LG D285 отзывы покупателей | 136 честных отзыва покупателей про Мобильные телефоны LG D285
Достоинства:
* довольно хорошая фотокамера со вспышкой, которая классно светит в качестве фонарика
* простой интерфейс (не знаю, оригинальный андроид или доработан LG) и удобная клавиатура (эта вроде точно доработана)
* экран на 5+
* доступ к карте SD без снятия аккума
* удобно, что кнопка блокировки сбоку, а вход наушников ближе к краю, а не посередине
* ещё некоторые удобные решения
Недостатки:
* дурацкая кнопка переключения сим карт, нажимается всё время при работе одной рукой
* очень медленно соображает при отнесении руки с телефоном от уха, при разговоре, прежде чем включится экран около 2 секунд
* мало своей памяти, а устанавливаемые обновления сожрут её до конца (если рут не делать)
* обновление ОС с новым часовым поясом так и не пришло
* если отключен Knock Code лёжа в кармане, запросто отвечает на звонки и вообще разряжается гораздо быстрее (с Knock Code держит дня 3-4, без 2, редко 3)
* очень хилый вибратор, лёжа на столе, не слышен зато за счёт гладкой крышки ездит не горюй, что и послужило причиной печали.
..Комментарий:
Печаль потому, что после 6 месяцев использования, во время звонка он за счёт вибратора каким-то чудом съехал со стола и упал с высоты 80 см на паркет, стекло разбилось. По всей видимости, замена стекла обойдётся в цену нового аппарата…
Жаль… ведь хотя я не могу сказать, что он очень уж хорош, предыдущий девайс был Alcatel 918D (тоже двухсимочный, на андроиде 2.3) там было много того, чего здесь не хватает (светодиод-индикатор пропущенных вызовов и полученных смс, чувствительный вибратор, 7-10 дней без подзарядки…), но взяв в руки старый Alcatel, понимаю, что привык к LG …
Восстановление данных с LG L65 DUAL D285
Сервисный центр РемФон выполняет качественное восстановление данных с
устройства LG L65 DUAL D285 в небольшие сроки. Наши специалисты помогут вам в
самых сложных ситуациях, чтобы ваша информация не оказалась утраченной.
Квалифицированное восстановление данных
Современные электронные устройства могут хранить различную информацию, которая может быть утеряна или недоступна по различным причинам. При этом, вне зависимости от причины произошедшего, следует как можно раньше обратиться к нам, чтобы выполнить восстановление данных с L65 DUAL D285, в противном случае вся информация исчезнет навсегда. Чаще всего пропажа файлов происходит из-за того, что после экстренного выключения диск перестал загружаться или выгорание электронных компонентов на плате , устранить которые поможет извлечение информации с LG, включающее в себя:
- Замена блока магнитных головок
- Восстановление данных с рабочего телефона
- Извлечение данных из сбойных секторов
- Восстановление удалённых данных
Как восстановить данные
Данные могут пропасть с устройства при возникновении
различных программных и аппаратных дефектов, а также по неосторожности самих
пользователей.
Поэтому в нашем центре, расположенном около метро метро Тверская по адресу улица Тверская, 8,
при восстановлении данных с носителя LG, часто проводится и ремонт самого
устройства. В некоторых ситуациях вернуть устройству работоспособное состояние
оказывается невозможным, но при этом данные остаются сохранными.
Наши специалисты помогают клиентам даже в самых сложных случаях. Все работы по восстановлению информации с устройства L65 DUAL D285 у нас проводятся с гарантией. А перед началом работ СЦ проводит бесплатную диагностику гаджета.
Мы обладаем такими преимуществами, как:
- обязательная гарантия
- ремонт в присутствии клиента
- высокое качество
- свой склад запчастей
- конкурентоспособные цены
- онлайн-консультации
Ответы на все интересующие вопросы и подробную информацию о
нас можно получить на сайте, по номеру телефона +7 (495) 699-14-10 и в профиле социальной
сети через обратную связь.
Рейтинг на yell.ru:
Рейтинг yandex.ru:
Отзывы:
5/5 Отзывов: 16
| 80% ремонтов делаются в тот же день |
цена | стоимость детали включена |
|---|---|---|
| 0 | ||
| Восстановление данных с рабочего телефона | от 500 | |
| Извлечение данных из сбойных секторов | от 1800 | |
| Восстановление удалённых данных | от 4500 | |
| Восстановление данных после сброса настроек (hard reset) | от 4500 | |
| Восстановление информации из смартфона | от 1500 | |
| от 4600 |
Вопросы и ответы по ремонту LG L65 DUAL D285
Мы также ремонтируем
remont-lg-d285-l65-v-kieve
Сервисное обслуживание LG D285 L65
- Сервисный центр Мастерфон производит профессиональный и качественный ремонт мобильного телефона D285 L65
-
Мы предоставим гарантию на ВСЕ виды услуг по ремонту D285 L65 совершённых в нашем сервисном центре.
- Сервисный центр предоставляет гарантию на корпуса и запчасти для D285 L65, приобретенные и установленные в нашем сервисном центре.
Характеристики
Экран 4.3″ IPS (800х480) емкостный, Multi-Touch / моноблок / Cortex-A7 1.2 ГГц / камера 5 Мп + фронтальная 0.3 Мп / Bluetooth 4.0 / Wi-Fi b/g/n / 1 ГБ оперативной памяти / 4 ГБ встроенной памяти + поддержка microSD / поддержка 2-х СИМ-карт / разъем 3.5 мм / 3G / GPS / ОС Android 4.4.2 / 127.2 x 66.8 x 9.5 мм, 126 г
Подробнее:http://rozetka.com.ua/lg_l65_dual_d285_bl/p699474/
Достоинства
батарея, динамик, компактность, перфорированная задняя крышка.
Подробнее:http://rozetka.com.ua/lg_l65_dual_d285_bl/p699474/comments/page=2/
Недостатки и решения
|
Перепрограммирование LG d285
Раскодировка, разблокировка LG D285
Восстановление загрузчика LG D285
Сложный программный ремонт LG D285
Цена: уточнить |
|
|
|
Цвета: белый, черный
Замена защитного стекла отдельно — невозможна!
Наличие: должен быть в наличии
Цена: уточнять |
|
Наличие: должен быть в наличии
Цена: уточнять |
|
|
|
Замена крышки аккумулятора LG D285
Цена: уточнять
Наличие: должно быть в наличии на складе или под заказ |
|
Замена Аккумуляторной батареи для LG D285 Цена: уточнять Наличие: должно быть на складе |
|
|
Замена разъема гарнитуры LG D285
Цена: уточнять
Наличие: должно быть в наличии на складе или под заказ |
Добавить комментарий
LG SCHEMATICS SERVICE MANUAL СХЕМЫ В ПАПКЕ НА ЯНДЕКС ДИСКЕ — LG — СХЕМЫ [SCHEMATICS] — ФАЙЛОВЫЙ РАЗДЕЛ
LG G1500 schematics
LG G1600 schematics
LG G1610 schematics
LG G1800 schematics
LG G3100 schematics
LG G4015 service manual
LG G4020 schematics
LG G5200 schematics
LG G5220C schematics
LG G5300 schematics
LG G5400 schematics
LG G5500 G7050 Schematics
LG G5600 schematics
LG G7000A W7000 schematics
LG G7020 Schematics
LG G7030 Schematics
LG G7050 service manual
LG G7070 Schematics
LG G7100 schematics
LG G8000 Schematics
LG GB100 GB105 service manual
LG GB102 service manual
LG GB106 service manual
LG GB107 service manual
LG GB108 service manual
LG GB109 service manual
LG GB110 service manual
LG GB115 service manual
LG GB125 service manual
LG GB130 schematics
LG GB160 service manual
LG GB160a service manual
LG GB161 service manual
LG GB165 service manual
LG GB170 schematics
LG GB170 service manual
LG GB175 service manual
LG GB190 service manual
LG GB195 service manual
LG GB210 service manual
LG GB220 schematics
LG GB220 service manual
LG GB225 service manual
LG GB230 service manual
LG GB250 service manual
LG GB255 service manual
LG GB258 service manual
LG GB270 service manual
LG GB280 service manual
LG GB330 service manual
LG GC900 Service Manual
LG GD300s service manual
LG GD330 schematics
LG GD335 service manual
LG GD350 service manual
LG GD510 service manual
LG GD550 service manual
LG GD570 service manual
LG GD580 service manual
LG GD730 Service Manual
LG GD880 service manual
LG GD900 service manual
LG GD910 service manual
LG GM200 service manual
LG GM205 service manual
LG GM210 service manual
LG GM310 service manual
LG GM360i service manual
LG GM600 service manual
LG GM730 schematics
LG GM750 Service Manual
LG Google Nexus 4 Service Manual
LG GR500 service manual
LG GR700 service manual
LG GS101 GS102 service manual
LG GS105 service manual
LG GS106 service manual
LG GS107 service manual
LG GS107A service manual
LG GS107B service manual
LG GS108 service manual
LG GS117 service manual
LG GS155b service manual
LG GS170 service manual
LG GS190 service manual
LG GS205 service manual
LG GS290 service manual
LG GS290 сервис мануал
LG GS500F service manual
LG GS505 service manual
LG GT350 service manual
LG GT350f service manual
LG GT360 service manual
LG GT365 service manual
LG GT370 service manual
LG GT400 Service Manual
LG GT500 service manual
LG GT540 service manual
LG GT910s service manual
LG GU200 service manual
LG GU220 service manual
LG GU230 service manual
LG GU280 GU285 service manual
LG GU285G service manual
LG GU290F service manual
LG GU290V service manual
LG GU292 service manual
LG GU295 service manual
LG GW300 service manual
LG GW305 service manual
LG GW370 service manual
LG GW520 service manual
LG GW525 service manual
LG GW620 service manual
LG GW820 service manual
LG GW825 service manual
LG GW825V service manual
LG GX200 Service Manual
LG GX300 service manual
LG GX500 service manual
LG HB620t KB620 service manual L2 v1.
0
LG ID2750 service manual L2
LG ID3100 service manual L2 v1.0
LG ID90c service manual L2
LG KB770 service manual L2
LG KB775f service manual
LG KC550 service manual
LG KC560 service manual
LG KC780 service manual
LG KC910 service manual
LG KD3000 service manual
LG KD3500 service manual
LG KD877 service manual
LG KE260 service manual
LG KE500 service manual
LG KE520 service manual L2 v1.0
LG KE590i schematics
LG KE600 service manual
LG KE770 service manual
LG KE800 service manual
LG KE820 service manual
LG KE850 service manual
LG KE970 Service Manual
LG KE990 service manual
LG KE990d schematics
LG KF240 service manual
LG KF245C service manual
LG KF300 service manual
LG KF300e service manual
LG KF301 service manual
LG KF305 service manual
LG KF310 schematics
LG KF350 service manual
LG KF390 schematics
LG KF510 service manual
LG KF600 service manual
LG KF600w schematics
LG KF690 schematics
LG KF700 service manual
LG KF700Q schematics
LG KF750 service manual
LG KF755D service manual
LG KF757 service manual
LG KF900 service manual
LG KG108 Service Manual
LG KG110 schematics
LG KG120 service manual
LG KG130 service manual
LG KG190 service manual
LG KG195 service manual
LG KG200 service manual
LG KG208 Service Manual
LG KG210 schematics
LG KG220 schematics
LG KG225 schematics
LG KG245 schematics
LG KG270 service manual
LG KG271 KG276 service manual
LG KG280 service manual
LG KG285 service manual
LG KG288 service manual
LG KG290 service manual
LG KG296 service manual
LG KG300 service manual
LG KG320 schematics
LG KG330 service manual
LG KG370 service manual
LG KG376 service manual
LG KG70 service manual
LG KG77 schematics
LG KG800 MG800c schematics
LG KG810 service manual
LG KG90n service manual
LG KG920 schematics
LG Kh4900 Service Manual
LG KM330 service manual
LG KM380 service manual
LG KM380c schematics
LG KM385D service manual
LG KM386C service manual
LG KM500 service manual
LG KM500d schematics
LG KM501 service manual L2 v1.
0
LG KM553 service manual
LG KM555 service manual
LG KM555G service manual
LG KM555R service manual
LG KM570 service manual
LG KM710 service manual L2
LG KM710C service manual
LG KM710D service manual
LG KM900 service manual
LG KP100 service manual
LG KP105 service manual
LG KP107 service manual
LG KP107a service manual
LG KP108 saervice manual
LG KP109a service manual
LG KP109b service manual
LG KP110 service manual
LG KP115a service manual
LG KP130 schematics
LG KP135 service manual
LG KP150Q schematics
LG KP151Q service manual
LG KP152 service manual
LG KP168 service manual
LG KP169 service manual
LG KP170 KP175 schematics
LG KP199 schematics
LG KP200 service manual
LG KP202 service manual
LG KP203i service manual
LG KP210 service manual
LG KP220 service manual
LG KP230 service manual
LG KP233 service manual
LG KP260 service manual
LG KP270 service manual
LG KP275 KP275c service manual
LG KP293i service manual
LG KP320 service manual
LG KP330 service manual
LG KP500 schematics
LG KP500 service manual
LG KP502 KP550 service manual
LG KS10 service manual
LG KS20 service manual
LG KS200 schematics
LG KS360 service manual
LG KS500 service manual
LG KS660 service manual
LG KT520 service manual
LG KT525 schematic
LG KT610 service manual
LG KT615 schematic
LG KT878 schematic
LG KU250 U250 schematics
LG KU310 service manual
LG KU311 service manual
LG KU380 service manual
LG KU3800 schematics
LG KU4000 schematics
LG KU450 U450 schematics
LG KU580 service manual
LG KU730 service manual
LG KU800 schematics
LG KU830 U830 schematics
LG KU9300 schematics
LG KU950 schematics
LG KU970 U970 schematics
LG KU990 service manual
LG KU990R schematics
LG KV220 service manual
LG KV226 service manual
LG KV230 service manual
LG KV500 service manual
LG KV510 service manual
LG KV600 service manual
LG KV700 service manual
LG KV800 service manual
LG KX156 schematic
LG KX206 schematic
LG L-04C schematic
LG L-06A Service Manual
LG L1100 schematics
LG L1150 Service Manual
LG L1400 Service Manual
LG L3100 schematics
LG L342i schematics
LG L343i service manual
LG L600v schematics
LG L601i service manual
LG L602i service manual
LG L704i schematics
LG L705i service manual
LG L705ix service manual
LG L706ie service manual
LG L852i schematic
LG LG300G schematics
LG LG400GT schematics
LG LG570 Service Manual
LG LG9200 schematics
LG LN240 service manual
LG LN510 service manual
LG LS670 service manual
LG LS980 service manual
LG LU3100 service manual
LG LW690 schematic
LG LX140 Service Manual
LG LX260 service manual
LG LX400 schematics
LG LX600 schematics
LG M4410 schematics
LG M6100 schematics
LG MC2670 schematic
LG MC3410 schematic
LG MC3500 schematics
LG MC3600 schematics
LG MC6250 schematic
LG MC820 schematics
LG MD120 service manual
LG MD3500 schematics
LG ME240 service manual
LG ME550d schematics
LG ME820 schematics
LG ME850 schematics
LG ME970 schematics
LG MG100 service manual
LG MG105 service manual
LG MG120a service manual
LG MG120b service manual
LG MG125a schematics
LG MG150 service manual
LG MG180C service manual
LG MG185C service manual
LG MG191A service manual
LG MG200 service manual
LG MG210 service manual
LG MG220 service manual
LG MG225D service manual
LG MG230D service manual
LG MG280 schematics
LG MG300d service manual
LG MG810C service manual
LG MN240 schematic
LG MN510 schematic
LG MS20 service manual
LG MS25 schematics
LG MS690 schematic
LG MT310 schematics
LG MU500 MU550 service manual
LG MU515 service manual
LG MU515 service manual
LG MX275 schematics
LG MX380 schematics
LG MX8550 schematic
LG P350 service manua
LG P355 service manual
LG P500 schematics
LG P500 service manual
LG P500H service manual
LG P503 service manual
LG P504 service manual
LG P505 P506 service manual
LG P520 service manual
LG P610S service manual
LG P690 Service manual
LG P692 Service Manual
LG P693 service manual
LG P698 Service Manual
LG P700 Service Manual
LG P705 Service Manual
LG P710 service manual
LG P713 Service Manual
LG P714 service manual
LG P716 service manual
LG P7200 schematics
LG P725 Service Manual
LG P760 Service Manual
LG P765 Service Manual
LG P768 service manual
LG P769 service manual
LG P870 service manual
LG P875 Service Manual
LG P880 Service Manual
LG P895 Service Manual
LG P920 service manual
LG P925 service manual
LG P936 Service Manual
LG P940 Service Manual
LG P970 Service Manual
LG P990 service manual
LG P999 service manual
LG PX240 schematics
LG PX5400 Service Manual
LG PX800 schematics
LG PX8700 schematics
LG RD10000 schematic
LG RD2750 schematic
LG RD3500 schematic
LG RD3510 schematic
LG RD3600 schematic
LG RD6100 schematic
LG RD6250 schematic
LG RD6600 schematic
LG RD9100 schematic
LG S310 service manual
LG S5000 schematics
LG S5100 schematics
LG S5200 schematics
LG SU100 service manual
LG SU130 service manual
LG SU200 KU2000 service manual
LG SU210 KU2100 service manual
LG SU370 KU3700 service manual
LG SU410 service manual
LG SU420 service manaul
LG SU430 KU4300 service manual
LG SU630 KU6300 schematics
LG SU660 service manual
LG SU900 KU9000 service manual
LG SU910 KU9100 service manual
LG SU920 KU9200 service manual
LG SU950 KU9500 service manual
LG SU960 KU9600 service manual
LG T300 service manual
LG T310 service manual
LG T310i service manual
LG T315i Service Manual
LG T320 service manual
LG T325 service manual
LG T370 Service Manual
LG T375 service manual
LG T500 service manual
LG T510 Service Manual
LG T5100 schematics
LG TB260 service manual
LG TE365 service manual
LG TM250 Service Manual
LG TM300 Service Manual
LG TU330 service manual
LG TU500 service manual
LG TU550 service manual
LG TU575 service manual
LG TU750 service manual
LG U300 schematics
LG U310 service manual
LG U370 service manaul
LG U400 schematics
LG U8100 schematics
LG U8110 schematics
LG U8120 schematics
LG U8130 schematics
LG U8138 schematics
LG U8150 service manual
LG U8180 schematics
LG U8210 service manual
LG U8290 schematics
LG U8290 service manaul
LG U8330 schematics
LG U8360 schematics
LG U8380 schematics
LG U8500 schematics
LG U8550 schematics
LG U880 schematics
LG U890 U890C service manaul
LG U900 service manual
LG U960 service manual
LG UD2750 schematic
LG UD3100 schematic
LG UD3520 UD3530 schematics
LG UD3600 schematic
LG UD6100 schematics
LG UD6250 schematic
LG UD90c schematics
LG UN430 schematic
LG UN510 schematic
LG UN610 schematic
LG US670 schematic
LG US740 schematic
LG UX210 service manual
LG UX260 schematics
LG UX380 schematics
LG V900 optimus pad service manual
LG V9000 schematics
LG V909DW Service Manual
LG VM101 service manual
LG VM265 service manual
LG VM510 service manual
LG VN250 service manaul
LG VN270 service manual
LG VN530 service manual
LG VS660 service manual
LG VS740 service manaul
LG VS750 service manual
LG VS980 service manual
LG VX10000 schematics
LG VX5400 schematics
LG VX8350 schematics
LG VX8360 schematics
LG VX8500 schematics
LG VX8560 schematics
LG VX8610 service manual
LG VX8700 Service Manual
LG VX8800 schematics
LG VX9100 schematics
LG VX9700 schematics
LG W3000 schematics
LG W7000 service manual
LG W7020 schematics
LG watch phone GD910 service manual
LG X260 service manual
LG X330 schematics
LG X350 service manual
LG YD2750 Service Manual
LG YD6250 schematics
Сенсорный экран (тачскрин) Original LG L65 Dual D285.
Черный Новый сенсорный экран (тачскрин, стекло экрана) В нашем магазине вы можете купить дисплей, сенсорный экран или другие запчасти телефона. Гарантийный срок — 30 дней с момента покупки. Срок эксплуатации не ограничен. Возможна недорогая и качественная установка! Осуществляется замена дисплея, замена экрана, замена стекла и другой ремонт телефонов. Срочный ремонт на месте от 30 минут! Осуществляя ремонт нашими частями, мы держим самые низкие цены на работу. Возможна доставка и пересылка почтой в ваш город.
ФАКТЫ О ДИСПЛЕЕ:
» Ваш новый lcd экран имеет слой антибликового покрытия и надежно защищен от царапин.
» Большинство людей при покупке мобильного телефона или фотоаппарата не задумываются о том какой дисплей в нем использован и сталкиваются с проблемами эксплуатации уже после покупки.
» Самая частая причина повреждения дисплеев — угловые удары, а не разбитое стекло. Если в телефоне вокруг дисплея рамка пластиковая, а не металлическая, любой угловой удар безвозвратно повредит матрицу, что вызовет появление пятен и полос на экране Вашего телефона.
» Схема подсветки дисплея использует специальный алгоритм, определяющий яркость подсветки дисплея в зависимости от внешней освещенности помещения.
» Первые эксперименты по созданию жидких кристаллов (liquid crystal (display), отсюда LCD) были предприняты еще в 60-х годах, т.е. задолго до появления сотовых телефонов. Однако лишь спустя десятилетия они стали впервые применяться в мобильных телефонах, так появились Дисплеи известных марок.
» Яркость дисплея, изготовленного по технологии LCD/TFT (на основе жидких кристаллов) почти в два раза превышает яркость дисплеев CSTN.
» Дисплей TFT является улучшенной версией дисплея STN. Изначально производители отказались от использования дисплеев CSTN в связи с низкой яркостью и плохой контрастностью изображения.
» Технология производства дисплеев LCD постоянно улучшается, происходит это примерно каждые 6 месяцев.
» Преимущества дисплеев LCD:
— Низкое потребление энергии.
— Высокая антибликовая устойчивость экрана.
— Низкая стоимость эксплуатационных расходов и долговечность.
— Высокая яркость матрицы, высокая яркость подсветки. Информация хорошо читается даже на ярком солнце.
» Жидкие кристаллы не потребляют энергии, так как не излучают свет, а только отражают его. Именно поэтому дисплей изготовлен по технологии LCD.
» Для ухода за дисплеем мы рекомендуем использовать Набор для полировки дисплея. В комплекте тюбик пасты DISPLEX и специальная безворсовая салфетка для нанесения пасты на экран телефона.
» Для дисплеев LCD очень вреден нагрев, а особенно прямой солнечный свет. Никогда не оставляйте мобильный телефон на солнце, а также в запертом автомобиле в жаркую погоду.
ЖК дисплей (экран телефона). Купить экран! Купить тачскрин! Купить дисплей! Только в 1AMPER.BY!
Дроссель-клапан круглый Р-111 d=285, цена 2 024 руб., комплектующие для систем вентиляции от «ТД КОМТЕХ»
Дроссель-клапаны круглые Р
Дроссель-клапаны круглые предназначены для регулирования потока воздуха, проходящего по круглым воздуховодам.
Дроссель-клапаны изготавливаются в климатическом исполнении — У (умеренный климат) 2-й категории размещения по ГОСТ 15150-69.
Габаритные и присоединительные размеры дроссель-клапана круглого типа Р
| Обозначение | Размеры, мм | |||
| D | D1 | D2 | l | |
| P-101 | 100 | 130 | 152 | 125 |
| P-102 | 115 | 145 | 167 | 135 |
| P-103 | 130 | 160 | 182 | 150 |
| P-104 | 140 | 170 | 192 | 160 |
| P-105 | 150 | 180 | 202 | 170 |
| P-106 | 165 | 195 | 217 | 185 |
| P-107 | 195 | 230 | 257 | 230 |
| P-108 | 215 | 250 | 277 | 250 |
| P-109 | 235 | 270 | 297 | 270 |
| P-110 | 265 | 300 | 327 | 300 |
| P-111 | 285 | 320 | 347 | 320 |
| P-112 | 320 | 350 | 382 | 355 |
| P-113 | 375 | 410 | 437 | 410 |
| P-114 | 440 | 475 | 502 | 475 |
| P-115 | 495 | 530 | 557 | 530 |
| P-116 | 545 | 580 | 607 | 580 |
| P-117 | 595 | 630 | 657 | 630 |
| P-118 | 660 | 705 | 744 | 695 |
| P-119 | 775 | 820 | 859 | 810 |
— возможно изготовление дроссель-клапана других размеров по заявке заказчика.
Звоните по телефону, +7 (343) 328-03-77 и наши специалисты, помогут вам подобрать нужную модель клапана.
Наши преимущества
- Наличие более 1000 видов вентиляционного и теплового оборудования на складе Екатеринбурга.
- Выгодные цены, сравнимые с ценами конкурентов.
- Доставка по всем регионам Российской Федерации.
- Рассмотрение заявок в короткие сроки и своевременная доставка заказа.
- Дополнительные скидки на покупки оптом, в зависимости от объема товара, и отсрочку платежа.
- Качество товара гарантировано, предоставляется вся необходимая документация.
|
Товар в наличии на складе | Высокое качество | Оперативная доставка | Скидки оптовикам |
Схема работы
| Вы отправляете заявку | |
| Мы выставляем Вам счет | |
| Вы оплачиваете покупку удобным для Вас способом | |
| Получаете свой товар |
swsun.
bitballoon.comШвейная машина Чайка. Ремонт и настройка. Инструкцию швейной машины Чайка можно использовать как руководство по эксплуатации любых моделей швейных машин, выполняющих строчку зигзаг типа Чайка Чайка 2, Чайка 3, Чайка 1. Эта инструкция швейной машинки Чайка подходит и для швейных машин Мальва и марки Подольск Подольск 1. Подольск 1. 42. М и др. Швейные машины типа Чайка, Подольск устроены одинаково. Эта инструкция швейной машинки Чайка подходит и для швейных машин Мальва и. При этом не допускается для чистки применять металлические. Руководство по эксплуатации швейной машины Подольск класса 2М. Ножная машина приводится в движение попеременным нажатием то носками, то каблуком на подножку. Нельзя применять недоброкачественную иглу. Вс о ремонте и обслуживании швейной машинки ПОДОЛЬСК, о том как правильно ею пользоваться и шить на сайте. Данная инструкция эксплуатации швейной машины Чайка дана в сокращенном виде, на основе инструкции завода изготовителя. Эксплуатация и устройство швейной машины Подольск и Чайка практически однотипное, поэтому данное руководство по эксплуатации подойдет для всех моделей этих швейных машин, в том числе и для швейной машины Мальва.
Они имеют одинаковое устройство и отличаются только наличием дополнительных видов строчки зигзаг. У некоторых моделей Чайка и Подольская имеется для этого дополнительное устройство копир и соответственно рычаг переключение режимов его работы. Устройство челночного хода, заправки нитки и параметры регулировки узлов и механизмов этих швейных машин практически одинаковые, за исключением установки некоторых настроек параметров работы челночного хода в зависимости от модели машины. Подробно о том, как настроить и выполнить мелкий ремонт швейных машин типа Чайка смотрите в других статьях в разделе посвященном ремонту швейных машин. Описание швейной машины Подольск 142, как пользоваться, уход и т. д. Для смазки машины необходимо применять масло для швейных машин или масло. Как подготовить к работе винтажную швейную машинку, обслуживание. У меня Подольские ножная и ручная им. Кирова и им. Инструкция для швейных машин Чайка, Подольск. Сокращенный. Правильный подбор иглы одно из условий хорошей работы швейной машинки.
Каждая швейная машина имеет свою инструкцию по эксплуатации, но большинство машинок с качающимся челноком устроены одинаково. Органы управления и составные части машины Чайка, Подольск 1. Челночное устройство. Игольная пластина. Лапка нажимная. Игловодитель. Рычаг подъема лапки. Регулятор натяжения верхней нитки. Крышки верхняя и фронтовая. Рычаг нитепритягивателя. Шайбы натяжения. Указатель вида строчек. Указатель ширины зигзага. Стержень для катушки. Рычаг смещения иглы. Ручка зигзага. Рычаг обратной подачи. Ручка регулятора длины стежка. Ручка регулятора подъема гребенки. Двигатель материала. Панель рисунков. Ручка переключения блока копиров. Виды тканей для пошива, нитки и иголки для швейной машины Чайка, Подольск. Тонкие сорта шелка, батист. Заправка верхней и нижней нитки. Инструкция к швейной машине Чайка, Подольск. Заправка верхней нитки. Вытянуть катушечный стержень 1. Установить ушко нитепритягивателя в верхнее положение поворотом маховика. Поднять нажимную лапку. Установить на стержень 1.
Заправлять верхнюю нитку нужно в такой последовательности. В отверстия 7 и 6 пластинчатого нитенаправителя, между шайбами 8 регулятора натяжения, далее вверх в ушко 4 нитепритягивательной пружины, вниз под нитспритягивательный крючок 3, вверх через отверстие рычага нитепритлгиватсля 5, вниз в проволочный нитенаправитель 2, в нитенаправитель 1 на игловодителе и вдеть в ушко иглы 9 со стороны работающего. Заправка нижней нитки. Прежде чем заправить нижнюю нитку, нужно вытащить шпульный колпачок со шпулькой из челночного устройства, для чего необходимо поворотом маховика поставить иглу в верхнее положение. Выдвинуть задвижную пластинку, двумя пальцами левой руки захватить рычаг защелки шпульного колпачка и извлечь шпульный колпачок. Наматывание нитки. Инструкция к швейной машине Чайка, Подольск. Намотать нитки на шпульку с помощью моталки. При намотке нитки на шпульку маховик машины должен вращаться вхолостую. Для этого нужно освободить фрикционный винт 1 рис. Шпульку надеть на шпиндель моталки 2 так, чтобы пружина шпинделя вошла в прорезь шпульки.
Катушку 1 с нитками поставить на катушечный стержень. Нитку с катушки заправить между шайбами натяжения 4, как показано на рис. Моталку поджать к маховику. Далее производить намотку, вращая маховик с помощью привода. После того как шпулька будет полностью намотана, резиновое кольцо моталки перестанет соприкасаться с маховиком, и намотка прекратится. Перед снятием шпульки моталку необходимо отвести влево от упора 3. Заправить намотанную шпульку в шпульный колпачок и завести нитку под пружину натяжения, как показано на рис. Оставить свободный конец нитки длиной 1. Вставить шпульный колпачок со шпулькой, заправленной ниткой, в челночное устройство. При этом игла должна быть в верхнем положении. Шпульный колпачок со шпулькой надеть на стержень 3 челночного устройства до упора. При этом палец 1 шпульного колпачка должен войти в гнездо 2 рис. Управление машинкой. Инструкция к швейной машине Чайка, Подольск. При правильно вставленном шпульном колпачке рычаг защелки должен находиться в подпружиненном состоянии и при открывании стремиться возвратиться в исходное положение.
Перед началом шитья нижнюю нитку необходимо извлечь на игольную пластинку, для этого, придерживая конец игольной нитки, повернуть маховик так, чтобы игла опустилась в игольное отверстие, захватила нижнюю челночную нитку и поднялась в верхнее положение. Верхней ниткой вытянуть челночную нитку на игольную пластинку рис. Для шитья простой прямолинейной строчкой необходимо совместить цифру 0 на ручке 1. Ручка 2. 3 может быть в любом положении. Длина стежка устанавливается поворотом ручки 1. Обратное направление подачи материала для закрепки осуществляется путем нажатия рычага 1. Шаг обратной подачи свыше 2,5 мм остается постоянным в пределах 2,5 мм. Регулирование высоты подъема рейки производят регулятором 1 рис. Пользование регулятором производится при снятой задвижной пластине. Для толстых материалов регулятор устанавливается на отметку Н нормально, для тонких на отметку Ш шелк, для вышивания и штопки на отметку В вышивка. Буквы должны быть видны сверху. Для перехода на зигзагообразную, декоративную и целевую строчки необходимо ручку 2.
Поворотом ручки 1. Рисунок для отделки изделий будет более четким при меньшем шаге строчки. Смещением строчки пользуются при выполнении специальных операций, например, при обработке петель, вшивании. Для смещения строчки служит ручка 1. Поворотом ее до упора без усилия в направлении, указанном стрелками, игла смещается вправо или влево от среднего положения. Для проверки качества шитья рекомендуется сделать пробную строчку на лоскутке нужной вам ткани и при необходимости отрегулировать натяжение ниток. Регулирование натяжения верхней нитки осуществляется с помощью регулятора натяжения. Переплетение верхней и нижней нитки, должно происходить в середине сшиваемых материалов. Если переплетение ниток при образовании стежка находится сверху, нужно ослабить натяжение верхней нитки. Если переплетение ниток находится снизу, нужно усилить натяжение верхней нитки. При шитье через толстые и твердые места необходимо шить медленно, и маховое колесо поворачивать рукой. При шитье тонких материалов, например шелка и т.
После этого можно отпустить нитки и продолжать шить. После окончания шитья поднять нажимную лапку, оттянуть от себя сшиваемый материал и обрезать нитки о кромку нитеобрезателя, находящегося на стержне нажимной лапки рис. Уход, смазка. Инструкция к швейной машине Чайка, Подольск. Для обеспечения легкого хода машины и предупреждения износа все места, указанные стрелками, должны смазываться одной двумя каплями индустриального масла И 2. А ГОСТ 2. 07. 99 7. Места смазки головки машины рис. Места смазки механизма зигзага рис 1. Чистка и смазка челночного устройства рис. Тяжелый ход машины, а иногда и заклинивание может происходить от загрязнения хода челнока. Ход засоряется обрывками ниток, очесами ткани, пылью. См. Вытащите шпульный колпачок 1, поворотом пружинного замка на себя снять накладное кольцо 2, вынуть челнок 3. Гнездо челнока 4 осторожно очистить щеткой кисточкой от пыли грязи, ниток. При этом не допускается для чистки применять металлические предметы, чтобы не повредить чистоту рабочей поверхности Направление для челнока в корпусе хода и шпиндель моталки смазываются также 1 2 каплями масла.
Швейная машина. В свое время купить Чайку пришлось за немалые деньги, и она вроде шьет хорошо, вот только иногда петляет, в остальном же все целое и невредимое. Действительно сломать швейную машинку Чайка почти невозможно. Корпус из алюминия, детали все металлические, узлы крепкие и надежные все в стиле советской техники. Но вот, к сожалению, строчка петляетпрактически.
К сожалению, произошла ошибка
Что делать дальше
Прежде чем сообщить о проблеме, попробуйте выполнить следующие действия.
- Повторите запрос, используя действие обновления в браузере.
- Если обновление не удалось, попробуйте вернуться на предыдущую страницу и повторите действие, которое привело к этой ошибке.
- Если повторение действия по-прежнему вызывает ошибку, подождите несколько минут и попробуйте выполнить действие еще раз. Если кто-то еще сообщил нам о проблеме, мы уже попытаемся ее исправить.
Если все вышеперечисленные шаги завершились неудачно, свяжитесь с веб-командой, используя нашу онлайн-форму, и мы изучим проблему и исправим ее, как только сможем.
(Работаем с 9 по 5 с понедельника по пятницу).
Приносим извинения за неудобства и благодарим за то, что нашли время сообщить о проблеме.
Эти страницы интересны?
Наш путеводитель по опубликованной информации
Не можете найти то, что ищете? Попробуйте раздел раскрытия информации или спросите NED
Дата публикации :
Форма запроса FOI
Дата публикации :
Ваше право на информацию
В этом разделе вы найдете информацию о нас.Если вы не можете найти то, что ищете, попробуйте AskNed или раздел FOI.
Дата публикации :
Страховые компании
Руководство для страховых компаний, запрашивающих информацию в полиции Девона и Корнуолла.
По вопросам, связанным с дорожно-транспортным происшествием (RTC), обращайтесь в соответствующий раздел нашего веб-сайта: блок «Столкновения».
Дата публикации :
Схема публикации свободы информации
Дата публикации :
Детектор реликтовых аксионов электромагнитный (Технический отчет)
Моррис, Д. Э. Электромагнитный датчик аксионов реликвий . США: Н. П., 1984.
Интернет. DOI: 10,2172 / 6446664.
Моррис Д. Э. Электромагнитный детектор аксионов реликвий . Соединенные Штаты. https://doi.org/10.2172/6446664
Моррис, Д. Э.Вт.
«Электромагнитный детектор реликтовых аксионов». Соединенные Штаты. https://doi.org/10.2172/6446664. https://www.osti.gov/servlets/purl/6446664.
@article {osti_6446664,
title = {Электромагнитный детектор реликтовых аксионов},
author = {Моррис, Д. Э.},
abstractNote = {Аксионы - это частицы малой массы, которые постулируются для объяснения сохранения CP в сильных взаимодействиях.Предсказанные свойства аксионов объясняют раннее скопление вещества в галактики, массу в галактических гало и недостающую массу, достаточную для закрытия Вселенной. Взаимодействие аксионов с обычным веществом было бы чрезвычайно слабым, но аксионы должны быть обнаружены, потому что в сильном магнитном поле реликтовые аксионы с массой m / sub a / преобразуются в микроволновые фотоны с частотой f = m / sub a / c / sup. 2 // ч. Прогнозы для диапазона частот от 3 до 24 ГГц для реликтовых аксионов, которые обеспечивают плотность массы, достаточную для закрытия Вселенной.Предлагаем лабораторный поиск реликтовых аксионов. Описывается конкретная экспериментальная установка и оцениваются рабочие характеристики системы, чтобы проиллюстрировать принципы конструкции.
Микроволновый сигнал от аксионного преобразования создается в 30-литровом микроволновом резонаторе, который содержит диэлектрические фазосдвигающие пластины, чтобы обеспечить добротность (Q) более 10 / sup 6 / и обеспечить правильную фазировку микроволнового электрического поля по всей полости. . Резонатор помещается в сверхпроводящий магнит 8 тесла, и сигнал измеряется обычным микроволновым приемником, в котором используется ВЧ-усилитель на полевых транзисторах с GaAs или смеситель на диодах Шоттки.Резонатор, магнит и ВЧ усилитель / смеситель будут работать при 4 / sup 0 / K, с шумовой температурой от 20 / sup 0 / K до 200 / sup 0 / K. Система в принципе одинаково эффективна на всех частотах от 1 ГГц до 100 ГГц, на которых доступны микроволновые приемники. Соответствующий диапазон масс аксионов, который может быть покрыт, составляет от 4x10 / sup -6 / эВ до 4x10 / sup -4 / эВ. Поиск может быть проведен по октаве частоты в течение трех месяцев наблюдения с достаточной чувствительностью для обнаружения аксионов, если они составляют галактическое гало.
},
doi = {10.2172 / 6446664},
url = {https://www.osti.gov/biblio/6446664},
journal = {},
номер =,
объем =,
place = {United States},
год = {1984},
месяц = {5}
}
Международные отношения США, 1958–1960, Берлинский кризис, 1958–1959, Том VIII
285.Телеграмма из посольства в СССР Союз в Департамент Состояние0
Москва, 6 мая, г. 1959 г., 13:00
2204. Я считаю, что Советы приложат все усилия на встрече МИД в Женеве, чтобы обеспечить эту встречу на высшем уровне.
происходит.Существует возможность, что они постараются продемонстрировать
разумность путем достижения согласия по какому-то конкретному вопросу.
Большинство
вероятные предметы будут либо берлинским вопросом, либо атомными испытаниями
запрет. Альтернативный подход мог бы состоять в том, чтобы представить далеко идущие
схема, которая была бы полна ошибок с нашей точки зрения, таких как
вывод американских войск из Европы, но который будет содержать
достаточно привлекательных условий, от которых мы едва ли могли отказаться
обсудить их на Саммите.Предположите, что на встрече с Западным FM, непосредственно предшествующей конференции, может быть
полезно прийти к соглашению о том, что министры воздерживаются от любых
существенный комментарий неожиданных советских предложений, пока западные министры
имеют возможность изучить последствия и согласовать их
отношение.
В то время как указание Хрущева на
Монтгомери1 о своем желании отказаться от сепаратного мирного договора может
были всего лишь усилием отделения Британии от других западных держав, я
подозреваю, что у Советов были сомнения относительно целесообразности отдельного
договор.Сейчас кажется менее вероятным, чем раньше, что они могли получить
подписать внеблоковые страны, такие как Индия и Египет. Кроме того, их
позиция, что после сепаратного мирного договора с Восточной Германией Западная
права в Берлине будут аннулированы, это может поставить их в затруднительное положение.
ситуация, когда любой инцидент, спровоцированный восточными немцами, может столкнуться с ними
с требованиями выполнить свои обязательства по Варшавскому договору.
Международные отношения США, 1961–1963, Том XII, Американские республики
285. Меморандум специального помощника Президента по национальным По вопросам безопасности (Банди) исполняющему обязанности заместителя помощника госсекретаря по европейским делам (Burdett) 1
Вашингтон, 6 августа, 1962 г.
Как я сказал вам по телефону, я коротко поговорил с лордом Худом,
по поручению президента прокомментировать ответ Великобритании на
предложения президента по Британской Гвиане.
Лорд Худ сказал мне, что он
не был проинформирован об ответе по этому другому каналу. я сказал ему
его общий характер и указывает на озабоченность президента тем, что исследование
такой вид может означать долгую задержку в достижении согласованного U.S./U.K.
должность. Я сказал лорду Худу, что с нашей точки зрения
значительная срочность в этом вопросе, и пока намного лучшая схема
будет действовать по согласованию с Великобританией, нам было бы жаль
иметь препятствия действиям из-за продолжительных дискуссий взад и вперед. [3 строки исходного текста не рассекречены]
Тем не менее, я сказал, что Президент просил меня передать это
указать на лорда Гуда для дальнейшего общения с послом или
министерство иностранных дел, поскольку он может счесть полезным.
[1 абзац (5 строк исходного текста) не рассекречено]
Я отправляю этот меморандум только вам [менее 1 строка исходного текста не рассекречена] и рассчитываю на то, что вы организовать любое существенное ограниченное распространение в вашем соответствующем империи.
% PDF-1.5 % 1 0 obj > эндобдж 2 0 obj > поток х-1 @ ~ O1V] $ j + (XA7! D ؍ t | s4 ‘: e%} ٜ! «uK բ +% Ī: v} cr] f ߑ˔4 g RQ 8 {* конечный поток эндобдж 3 0 obj > поток q конечный поток эндобдж 4 0 obj > поток Q конечный поток эндобдж 5 0 obj > поток конечный поток эндобдж 6 0 obj > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB / ImageC / ImageI] >> / MediaBox [0 0 595,32 841,92] / Содержание [5 0 R 3 0 R 17 0 R 4 0 R 2 0 R] / Группа> / Вкладки / S / StructParents 0 >> эндобдж 8 0 объект > эндобдж 18 0 объект > эндобдж 19 0 объект [250 0 0 0 0 0 0 0 333 333 0 0 0 0250 0500500500500 0500500500 0 500 333 0 0 0 0 0 0 722 0 722 0 667 611 0 778 389 0 0 667 944 722 778 611 0 722 556 667 722 0 1000 0 0 0 0 0 0 0 0 0500 556 444 556 444 333 500 556 278 0 556 278 833 556 500 556 0 444 389 333 556 0 722 500 500] эндобдж 9 0 объект > эндобдж 20 0 объект > эндобдж 21 0 объект [250 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0500 0 0 0500 0 0500500 0 0 0 0 0 0 0667 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 611 0 0 0 611 0 667 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 444 500 444 0 500 556 278 0 0 278 0 556 0 0 0 0 0 278 556] эндобдж 10 0 obj > эндобдж 22 0 объект > эндобдж 23 0 объект [250 0 0 0 0 0 0 0 333 333 0 0250 333250 0500 500 500 500 500 500 500 500500500 278 278 0 0 0 0 0 722 667 667 722 611 556 0722 333 0 0 611 889 722 722 556 0 667 556 611 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0500 0 444 500 444 500 444 333 500500 278 0500 278 778 500 500 500 0 333 389 278 500 500 722 500 500 444 ] эндобдж 11 0 объект > эндобдж 24 0 объект > эндобдж 25 0 объект [250 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0250 0500 500 500 500 0500 0 0500 500 0 0 0 0 0 0 0 611 0 0 0 0 611 0 0 333 0 0 556 0 667 0 611 0 611 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0500500 444 500 444 278 500 500 278 0 0 278 722 500 500 0 0 389 389 278 500 444] эндобдж 26 0 объект > эндобдж 27 0 объект > поток x xTE: kNwB6; bwBb% H: + K H ى @ = t ͨ @ E ?? w} zsw’k_u ު zOU: 4 # xK] I-% es? {) w
‘HLWOVU Գ Є [ꠉ U = bO \ D4a «[ iYSj_G [VOii.
% * YIl̸s #} dl8 ~ ǩxuD / \ FI6b / 5 裶 d: m \ bQ ⢥ u7 ~
Disney Fairy Tale Weddings Свадебные платья
Повод
СвадебныеПодружки невестыПовседневные платьяКоктейльные платьяПричастиеВечерЦветочная девушкаПлатья для девочекВыпускные платьяМать невесты / женихаВыпускные платьяКвинсеанераКрасная ковровая дорожкаSweet 16
Type
Бальные платьяBohoПлатье и жакетКружевные платьяМаленькое черное платьеМаленькое белое платьеДлинные платьяСдержанныеБрюкиПлатья с принтомSexy and SleekSheer SexyКороткие платьяЮбкаКостюмTopsTutuДва шт
Feature
Платья знаменитостейЦентральная замочная скважинаКорсетВысокая низкаяМногослойностьОткрытая спинаПлитированныеПлюсные размерыВ наличииРазрезанные прорези
Стиль спины
Перекрытые пуговицы Скрещенные ремниШнуровкаНизкая открытая застежка-молния 9000
Цветовая схема
Блестящий металлик Неон Омбре Пастель
Украшение
АппликацииБисероплетениеЛанкиКристаллическая брошьВышитоеПероЦветы БахромаКружеваРюфлёнкаБлестки
Ткань
ШармезШифонПероТрикотажКружевоСеткаОрганзаСатинС блесткамиШелкТафтаТюль
Подол / со шлейфом
До щиколоткиАсимметричный шлейф с часовым шлейфомЦентральный шлейфДлина до полаДлина коленаКороткое / миниатюрное со шлейфом со шлейфомДлина чайного с шлейфом Watteau
Вырез
Вырез-хомутХолтерВысокий вырезДрагоценный вырезНизкий V-образный вырезОткрытые плечиОдно плечоПортретЗубчатый вырезВоротный вырезПрозрачный вырезБез бретелекSweetheartV-образным вырезом
Силуэт
Трапеция / PrincessEmpire WaistMermaidSlim Fit
Рукав
Рукав 1/2 Рукав 3/4Длинные рукаваПрозрачные длинные рукаваКороткие рукаваБез рукавов
Ремешки
Ремешки-колпачки Обычные ремниСпагетти-ремниБез бретелек
VPS34 Стимуляция фосфорилирования p62 для прогрессирования рака
Каспаза 8 играет важную роль в слиянии аутофагосомы с лизосомой
LBH589 — ингибитор гидроксамовой кислоты деацетилаз гистона, который клинически используется для лечения множественной миеломы и в настоящее время проходит клинические испытания в качестве лекарственного средства.
потенциальное лечение других видов рака.Наши предыдущие исследования предполагают, что LBH589 вызывает апоптоз и аутофагию в клетках рака груди. 17 Чтобы выяснить, индуцирует ли LBH589 апоптоз в основном за счет активации каспазы 8, для лечения клеток MCF-7 с помощью LBH589. Апоптотическая гибель клеток полностью предотвращалась z-VAD-fmk и значительно блокировалась z-IETD-fmk ( P <0,05) (рис. 1a). Согласно вестерн-анализу, z-VAD-fmk и z-IETD-fmk значительно ингибировали процессинг каспазы 7, каспазы 8 и каспазы 9, что приводило к снижению расщепления PARP 1, индуцированного LBH589 (рис. 1b).Точно так же большая часть потери жизнеспособности клеток, обработанных LBH589, была снижена с помощью z-VAD-fmk и z-IETD-fmk (рис. 1c). Следовательно, капспаза-8 играет ключевую роль в гибели клеток, индуцированной LBH589.
Ингибирование каспазы 8 способствует слиянию аутофагосомы с лизосомой. ( a ) Ингибирование LBH589-индуцированного апоптоза ингибиторами каспаз.
Апоптотическая гибель клеток MCF-7, индуцированная обработкой указанных концентраций LBH589 и / или ингибиторов каспаз в течение 48 часов.Для лечения ингибитором каспаз клетки предварительно обрабатывали 10 мкМ z-VAD-FMK (Z-VAD) или z-IETD-FMK (IETD) в течение 4 часов. ( b ) Z-VAD или IETD ингибировали LBH589-индуцированное расщепление каспазы 7, каспазы 8, каспазы 9 и PARP-1 в клетках MCF-7, обработанных, как указано, в течение 24 часов. ( c ) Жизнеспособность клеток MCF-7, обработанных, как указано, в течение 24 часов. ( d ) Накопление Vps34, LC3 и p62 в клетках MCF-7, обработанных, как указано, 20 мкМ хлорохина или без него в течение 24 часов. ( e ) Конфокальная микроскопическая оценка слияния аутофагосома-лизосома в клетках MCF-7.Клетки MCF-7, стабильно экспрессирующие EGFP-LC3 (зеленый), обработанные, как указано, в течение 18 ч, были окрашены с помощью окрашивания лизосомным трекером (красный). Иммунофлуоресцентный анализ проводили с использованием конфокальной микроскопии (63 × масло).
Слева репрезентативные конфокальные изображения. Справа: относительный зеленый + красный + точек на ячейку, рассчитанный из 20 ячеек; бары, с.д. ** P <0,01. ( f ) Нарушение слияния аутофагосома-лизосома в клетках MCF-7. Клетки MCF-7, стабильно экспрессирующие tfLC3, обрабатывали, как указано, в течение 18 часов.Иммунофлуоресцентный анализ проводили с использованием конфокальной микроскопии (60 × масло). Слева репрезентативные конфокальные изображения. Справа:% автолизосом на клетку рассчитывали из 20 клеток по формуле (1-желтые точки / красные точки) × 100; бары, с.д. ** P <0,01. DAPI, 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол.
Исследования также показали, что аутофагия играет защитную роль в LBH589-индуцированном апоптозе. 17 Чтобы подтвердить индукцию аутофагии в этих условиях, аутофагический поток анализировали вестерн-блоттингом маркеров аутофагии.Воздействие LBH589 вызвало созревание аутофагии, на что указывают повышенные уровни LC3 и пониженные уровни p62, который расщепляется в автолизосоме и восстанавливается лизосомным ингибитором хлорохином (рис.
1d). Однако совместное лечение LBH589 и ингибиторами каспаз дополнительно увеличивало уровень Vps34, LC3 и p62 (рис. 1d). Повышенные уровни p62 указывают на то, что z-VAD-fmk и z-IETD-fmk могут нарушать слияние аутофагосома-лизосома. В качестве специфического ингибитора каспазы 8, z-IETD-fmk, использовали для изучения участия каспазы 8 в слиянии аутофагосомы с лизосомой.Совместная локализация EGFP-LC3 (зеленые точки) и лизосомотропного красителя (LysoTracker RED, красные точки) была индуцирована с образованием желтых точек и желтых точек с преобладанием красного в ответ на обработку LBH589 в клетках MCF-7, стабильно экспрессирующих EGFP-LC3. Кроме того, z-IETD-fmk предотвращал совместную локализацию зеленых точек GFP-LC3 с красными точками LysoTracker, демонстрируя усиление зеленого и красного сигналов флуоресценции отдельно в цитоплазме, что проявлялось в клетках, обработанных комбинацией LBH589 и z-IETD- fmk, в отличие от клеток, обработанных одним LBH589 (рис. 1e).Это было дополнительно подтверждено на клетках MCF-7, стабильно экспрессирующих mCherry-GFP-LC3 (tf-LC3), что обработка LBH589 индуцировала созревание аутофаголизосом (mRFP + GFP —, точки с преобладанием красного), но z-IETD- fmk блокировал слияние аутофагосомы с лизосомой (mRFP + GFP + , желтые точки) (рисунок 1f).
Эти результаты показали, что LBH589, вероятно, проявляет свои цитотоксические эффекты преимущественно через каспазу 8-зависимый путь, а активированная каспаза 8 усиливает созревание аутофаголизосом.
Активная каспаза-8 расщепляет Vps34 в D285
Интересно, что мы также наблюдали, что комбинация ингибитора каспазы 8 с LBH589 индуцировала более сильное накопление Vps34, чем обработка только LBH589 (рис. 1d). Это открытие побудило нас исследовать корреляцию между каспазой 8 и Vps34. Посттрансляционная модификация Sumo 1 стабилизирует и усиливает активность Vps34. 17 Следовательно, влияние каспазы 8 на SUMOylation Vps34 первоначально оценивалось по осаждению гранулами Ni помеченного флагом Vps34 в экстрактах клеток HEK293T, коэкспрессирующих His-tagged Sumo 1, flag-Vps34 и каспазу 8 ( Wt) или его доминантно-отрицательный мутант (Mt).По сравнению с контрольными клетками в присутствии LBH589 активная каспаза 8 устраняла значительное количество SUMO -илированного Vps34 и почти полностью устраняла экспрессированный flag-Vps34, который был спасен z-IETD-fmk, но не в случае каталитически неактивного мутанта.
каспазы 8 (рис. 2а). Более того, в отличие от ингибитора каспазы 8 z-IETD-fmk, ни ингибитор протеасом MG132, ни ингибитор лизосом хлорохин не спасали экспрессию Flag-Vps34, деградированную LBH589-активированной каспазой 8 (рис. 2b).Экзогенный Vps34 истощался в зависимости от дозы LBH589-активированной каспазой 8 (рис. 2c). Эти результаты показали, что активная каспаза 8 элиминирует Vps34 посредством ферментативного расщепления.
Vps34 расщепляется активной каспазой 8. ( a ) Активная каспаза 8 элиминировала SUMOylated Vps34 и общий Vps34. Иммуноблоттинг His-SUMO1-конъюгированного Vps34 и общего Vps34 в клетках HEK293T, трансфицированных, как указано, в течение 24 часов и обработанных LBH589 в течение 24 часов. ( b ) За исключением z-IETD-FMK (20 мкМ), ни MG132 (10 мкМ), ни хлорохин (20 мкМ) не блокировали отмену F-Vps34, вызванную активной каспазой 8.Как указано, иммуноблот-анализы проводили на трансфицированных клетках HEK293T.
( c ) Активная каспаза 8 разрушала Vps34 дозозависимым образом. Vps34 экстрагировали из клеток HEK293T, трансфицированных, как указано. ( d ) Иммуноокрашивание эндогенного Vps34 (зеленый), колокализованного с активной каспазой 8 (красный), в клетках MCF7, обработанных LBH589 и / или z-IETD-FMK, в течение 18 часов. ( e ) Прекращение эндогенного расщепления Vps34 ингибиторами каспаз в обработанных LBH589 клетках MCF-7. Красная стрелка обозначает расщепленный Vps34.( f ) Верхний, иммуноблот-анализ вариантного мутанта экспрессии Vps34 в клетках HEK293T в присутствии LBH589 в течение 24 часов. Ниже показано расположение предполагаемых сайтов расщепления в структуре схемы Vps34. ( г ) Расщепление Vps34 каспазой 8 по сайту Asp285. Иммуноблоттинг вариантов мутантных эффектов на экспрессию Vps34 в клетках HEK293T, котрансфицированных каспазой 8, обработанных 50 нМ LBH589 в течение 24 часов. ( h ) Расщепление in vitro Vps34 активной каспазой 8.Красная стрелка обозначает расщепленный Vps34.
( i ) Множественное выравнивание Vps34 показывает сохранение сайта расщепления каспазой 8 в мотиве SDHD. DAPI, 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол.
Аутофагия часто возникает в раковых клетках во время химиотерапии, что вызывает апоптоз. Предыдущие исследования выявили сложную взаимосвязь между белками, связанными с апоптозом, и аутофагией. Аутофагия может подавляться антиапоптотическими белками BCL2, BCL-XL и MCL1; 18, 19, 20 аутофагия, однако, может запускаться проапоптотическими белками BAD, PMAIP1 и BBC3. 21, 22 Что еще более важно, белки, связанные с аутофагией, такие как p62, 23 NBR1 23 и несколько белков ATG, включая ATG4D, 24 ATG5 25 и Beclin-1, 26, 27, 28 может расщепляться кальпаином или каспазами. Помимо этих белков, Vps34 также расщепляется каспазой 3, каспазой 7, каспазой 8 и каспазой 9 во время апоптоза, индуцированного фактором роста или лишения сыворотки. 27 В клетках MCF-7, дефицитных по каспазе 3, активная каспаза 8 (красный) колокализовалась с эндогенным Vps34 (зеленый), индуцированным обработкой LBH589 (рис.
2d).Чтобы проверить, отвечает ли каспаза 8 за расщепление эндогенного Vps34, zVAD, IETD и ингибитор каспазы 9 z-LEDH-fmk (LEDH) использовали индивидуально для обработки клеток вместе с LBH589. LBH589-индуцированное расщепление Vps34 ингибировалось как zVAD, так и IETD, но не LEDH в клетках MCF-7 (рис. 2e). Чтобы проверить сайт расщепления Vps34 активной каспазой 8, восемь мутантов Vps34 были сконструированы в соответствии с предсказанием CASVM, 29 , в которых определенные остатки аспарагиновой кислоты (D) были заменены глутаминовой кислотой (E) в различных областях, кроме каталитический домен, как показано на рисунке (рис. 2f-внизу), и все мутанты Vps34 хорошо экспрессируются в клетках HEK293T (рис. 2f-верх).Подобно Vps34 дикого типа, семь из восьми мутантов деградировали в присутствии LBH589 активированной каспазы 8, в то время как только мутация D в E в сайте Asp-285 была устойчивой к расщеплению (рис. 2g), что позволяет предположить, что D285 способствует Vps34 расщепление.
Это было подтверждено анализом in vitro на расщепление каспазой с использованием GST-меченного Vps34, инкубированного с активными каспазами 8 (фиг. 2h). Эти результаты подтверждают, что каспаза 8 ответственна за LBH589-индуцированное расщепление как эндогенного, так и экзогенного Vps34.Кроме того, было выполнено множественное выравнивание продолжающегося мотива SDHD этого Asp-285, чтобы исследовать его относительную важность для Vps34. Мотив SDHD был высококонсервативным у широкого круга видов, включая других млекопитающих (рис. 2i). Следовательно, Vps34 является прямым субстратом каспазы 8, а консервативная последовательность SDHD (аминокислоты 282–285 Vps34) является сайтом-мишенью каспазы-8 на этом белке.
D285 структурно влияет на активность и функцию Vps34
Далее мы исследовали, влияет ли блокирование расщепления Vps34 на его активность PI3K и соответствующие биологические функции.Поскольку сайт расщепления (D285) каспазой 8 расположен на N-конце спиральной области, мы создали конструкции для экспрессии маркированного флагом Vps34-полной длины (Wt, 1-887 аминокислотных остатков), Vps34-D1 (D1, 1 -285 а.
о.), Vps34-ΔD1 (ΔD1, 285-887 а.о.) и Vps34-Mt (Mt, D285E) для его функционального анализа. Поскольку Beclin-1 является критическим компонентом комплекса PI3K класса III (PI3KC3), который играет ключевую роль в пути аутофагия-лизосома, Vps34-Wt, Vps34-D1 и Vps34-ΔD1 были трансфицированы отдельно в HEK293T вместе с Myc- помеченный Beclin-1, чтобы проверить изменение сборки комплекса Beclin-1 / Vps34.Результаты иммуноблоттинга показали, что расщепление Vps34 на D285 снижает его сродство с Beclin-1 (фиг. 3a). В соответствии с этим открытием, биохимический анализ подтвердил, что укорочение N-конца снижает выход уровней PI3P более чем в три раза по сравнению с Vps34 дикого типа, тогда как фрагмент D1 не проявляет активности липид-киназы PI3K из-за отсутствия каталитического домена киназы PI3K (рис. 3b). . Следовательно, N-конец Vps34 важен для его активности липидкиназы PI3K.
D285 структурно влияет на активность и функцию Vps34.( a ) Расщепление Vps34 на D285 ослабляет взаимодействие Vps34 с Beclin1 (Bcn 1).
Иммуноблоты Myc-Beclin1 в иммунопреципитатах M2 из клеток HEK293T, трансфицированных, как указано. ( b ) Эффект блокирования расщепления на активность in vitro липидкиназы Vps34; бары, с.д. * P <0,05; ** P <0,01. ( c ) и дополнительная фигура S1 Уровни экспрессии индикаторов ЕМТ и аутофагический поток в родительских клетках или клетках MCF-7, стабильно экспрессирующих Vps34, Vps34-D1, Vps34-ΔD1 и Vps34-Mt (D285E).( d ) In vitro инвазия родительских клеток MCF-7 или клеток MCF-7, стабильно экспрессирующих Vps34, Vps34-D1, Vps34-ΔD1 и Vps34-Mt (D285E). Столбец, средние данные трех независимых экспериментов; бары, с.д. * P <0,05. ( e ) Расщепление Vps34 на D285 снижает его способность способствовать образованию колоний. Клоногенные изображения родительских клеток, MCF-7 / Vps34, MCF-7 / Vps34-ΔD1 и MCF-7 / vsp34-Mt (D285E), сфотографированные на 14 день. ( f ) Количество колоний клеток, показанное на рисунке 3e, было посчитал.
Построенные значения представляют собой средние значения трех экспериментов плюс или минус стандартное отклонение. ** P <0,01.
Чтобы определить влияние расщепления Vps34 на его биологическую активность при раке молочной железы, мы установили стабильные трансфектанты клеток MCF-7, экспрессирующие помеченные флагом Vps34-Wt, Vps34-D1, Vps34-ΔD1 и Vps34-Mt для выполнения матригеля. анализ инвазии и анализ образования колоний. In vitro оценка показала, что сверхэкспрессия Vps34-Wt заметно увеличивала инвазивность клеток MCF-7, в то время как Vps34-D1 и Vps34-ΔD1 не имели эффекта, а Vps34-Mt статистически и значительно усиливали это увеличение (фиг. 3d).Подобные случаи также распространяются на оценку колоний (рис. 3e и f). Здесь мы также провели анализ аутофагического потока и обнаружили, что клетки MCF-7, стабильно экспрессирующие Vps34-Wt, резко увеличивают преобразование LC3 I в формы LC3 II и внутриклеточное накопление p62 и маркеров EMT Snail и Vimentin, но не Беклин1 и Е-кадгерин.
Как и ожидалось, стабильные клетки Vps34-Mt дополнительно усиливали накопление LC3, p62, а также Snail и Vimentin по сравнению с клетками Vps34 дикого типа, в то время как клетки, экспрессирующие D1 или ΔD1, этого не сделали (рисунок 3c и дополнительный рисунок S1).Взятые вместе, эти результаты предполагают, что неповрежденная структура необходима для функции Vps34, чтобы поддерживать инвазивность и образование колоний.
Vps34 усиливает экспрессию p62 транскрипционно через NRF2
Для дальнейшей оценки того, регулируется ли накопление Vps34, p62 и LC3 в ответ на совместную обработку LBH589 с ингибиторами каспаз транскрипционно, количественный анализ экспрессии с использованием qRT в реальном времени– ПЦР не проводились. Хотя были обнаружены небольшие изменения в мРНК LC3 и Beclin 1, мРНК p62 увеличивалась заметно, чем Vps34, в клетках MCF-7, обработанных LBH589 и ингибитором каспаз (рис. 4a).В сочетании с предыдущим наблюдением, что сверхэкспрессия Vps34 в клетках MCF-7 усиливает индукцию p62, мы предположили, что Vps34 может стимулировать экспрессию гена p62.
Для проверки этой гипотезы был проведен анализ люциферазы с промотором p62 на трех клеточных линиях, а именно MCF-7, MDA-MB-231 и MCF10A. Как показано на фиг. 4b-d, временная эктопическая экспрессия Vps34 дозозависимо стимулировала активность промоторов p62, а уровень трансляции p62 положительно коррелировал с изменением Vps34.Эти результаты подтверждают, что Vps34 способствует экспрессии p62. Недавно сообщалось, что фактор транскрипции Nrf2 влияет на транскрипцию p62 и формирует петлю положительной обратной связи с Nrf2. 30, 31, 32 Таким образом, мы предположили, что Nrf2 может функционировать как регулятор транскрипции для Vps34-опосредованной активации p62. При трансфекции в клетки MCF-7 мы обнаружили, что Vps34 стыкуется непосредственно с Keap1, чтобы высвободить Nrf2 из комплекса, изолированного с помощью Keap1, адаптера лигазного комплекса Cul3-убиквитин E3, который деградирует Nrf2.При сверхэкспрессии Vps34 паттерн экспрессии как Keap1, так и Nrf2 не отличался в клетках MCF-7 (фиг.
4e). Интересно, что Vps34 дозозависимо извлекает Keap1 из комплекса Keap1-Nrf2 (Figure 4e) и приводит к снижению Nrf2 в цитоплазме и обогащению в ядре (Figure 4f). Обычно считается, что накопление в ядрах необходимо для того, чтобы Nrf2 функционировал как фактор транскрипции для p62. 31 Следовательно, мы затем определили, участвует ли Nrf2 в индукции Vps34 p62.Во-первых, мы проверили, является ли Nrf2 ключевым элементом для активации Vps34 p62, используя миРНК для нокдауна Nrf2, а затем оценили активность транскрипции p62 с помощью люциферазного анализа. Нокдаун Nrf2 эффективно снижает Vps34-индуцированную активацию промотора p62 и одновременно снижает увеличение p62, вызванное сверхэкспрессией Vps34 в клетках MCF-7 (Рисунок 4g), что согласуется с паттерном экспрессии Vps34 и p62 (Рисунок 1d). ; Рисунки 4б – г). Эти результаты показали, что Vps34 может инициировать Nrf2-активированную экспрессию p62 и собирает ось Vps34-Nrf2-p62.Следовательно, Vps34 выполняет внутреннюю функцию по модуляции уровней p62 посредством механизма диссоциации комплекса Keap1-Nrf2.
Vps34 усиливает экспрессию p62 транскрипционно через NRF2. ( a ) ПЦР-анализ в реальном времени Vps34, Beclin-1, LC3 и p62 в клетках MCF-7 при указанной обработке в течение 24 часов. Vps34 дозозависимо увеличивал транскрипционную активность промотора p62 в клетках MCF-7 ( b ), клетках MDA-MB-231 ( c ) и клетках MCF-10 A ( d ).Транскрипционная активность промотора p62 выражалась в виде относительных единиц люциферазы (RLU), нормированных на активность Renilla, а уровень экспрессии Vps34 и p62 дополнительно подтверждался вестерн-блоттингом клеточных лизатов. ( e ), ( f ) Vps34 дозозависимо усиливал экспрессию и связывание с Keap1, высвобождая Nrf2 для его ядерной транслокации. Клетки MCF7 трансфицировали конструкциями с увеличенным количеством FLAG-Vps34 в течение 48 часов, как указано. Иммуноблот-анализ Nrf2 в цитозольных экстрактах и ядерных экстрактах.( г ) Нокдаун Nrf2 устранял Vps34-индуцированную активацию промотора p62.
Клетки MCF-7 трансфицировали миРНК FLAG-Vps34 и / или Nrf2 за 24 ч до этого с последующим анализом люциферазы. Лизаты клеток анализировали иммуноблоттингом с антителами против Nrf2, анти-p62 и анти-β-актина.
Vps34 индуцирует PKC-δ-зависимое фосфорилирование p62
Селективность аутофагии зависит от адаптерных белков, таких как p62, для присоединения аутофагического аппарата к его специфическим субстратам. 33 Фосфорилирование по S349 способствует росту опухоли за счет разрушения комплекса Keap1-Nrf2 из-за высокого сродства S349-фосфорилированного p62 к Keap1. 34 Следовательно, Vps34 может стимулировать S349-фосфорилирование p62, белка, способствующего онкогенезу. 35 Протеинкиназа C (PKC) представляет собой семейство серин / треониновых протеинкиназ, состоящее из трех подсемейств, включая классические (α, βI, βII и γ), новые (δ, ɛ, θ и η) и атипичные (ξ и λ).p62 был первоначально идентифицирован как партнер по связыванию атипичной PKC.
36 Неожиданно было обнаружено, что p62 не является субстратом для классических и атипичных PKC (данные не показаны). Чтобы изучить возможность использования p62 в качестве субстрата для PKC, мы затем проверили, происходит ли фосфорилирование p62 S349 с помощью PKC δ, PKC или PKC η. Мы обнаружили, что только PKC-δ увеличивал фосфорилирование S349 в клетках HEK293T (рис. 5a) и дозозависимым образом (рис. 5b). Чтобы определить, фосфорилирует ли PKC-δ S349 из p62 in vitro , мы провели анализ фосфорилирования in vitro с использованием очищенного GST-слитого p62 и His6-PKC-δ, показав, что p62 фосфорилировался в S349 с помощью PKC-δ, но не PKC-δ с мутацией K378M, тогда как фосфорилирование S349 не наблюдалось в мутанте S349A (рис. 5c).Следовательно, PKC-δ является одной из протеинкиназ для фосфорилирования p62 по S349. Как и ожидалось, Vps34 дозозависимо усиливал S349-фосфорилирование p62 с помощью PKC δ в клетках HEK293T, что приводило к увеличению комплекса Keap1-p62 (p-S349) и уменьшению комплекса Keap1-p62 (p-S403) (рис.
5d). Что еще более интересно, нокаут Crispr-cas9 Vps34 аннулировал взаимодействие между p62 и PKC δ, что приводило к снижению PKC δ-зависимого фосфорилирования p62 в S349, сопровождаемого повышенным PKC δ-независимым фосфорилированием p62 в S403 в клетках MCF-7 (рис. 5e. ).Vps34 усиливает взаимодействие между Keap1 и фосфорилированным S349 p62 (фиг. 5d), в то время как эндогенный Vps34 существует в комплексе с Keap1 и предпочтительно образует комплекс с фосфорилированным S349, а не фосфорилированным S403 p62 (фиг. 5e). За исключением трансактивации Nrf2 путем разрушения комплекса Keap1-Nrf2 30, 34 при аутофагии, p62 также является многофункциональным и многодоменным белком, участвующим во многих других сигнальных путях и клеточных функциях, например, в удалении поврежденных митохондрии при паркин-опосредованной митофагии, 37, 38, 39 и активации NF-κB путем связывания и активации атипичных PKC, киназы RIP1 или TRAF6 (фактора 6, ассоциированного с рецептором TNFα).
40, 41, 42
Vps34 индуцирует PKC-δ-зависимое фосфорилирование p62. ( a ), ( b ) PKC δ представляет собой протеинкиназу, специфичную для p62 в клетках. Лизаты клеток MCF-7, трансфицированных, как указано, анализировали вестерн-блоттингом с антителами, распознающими фосфорилированный p62 по S349, Myc-tag, falg-tag и β-актин. ( c ) In vitro фосфорилирование p62 с помощью PKC-δ. ( d ) Vps34 дозозависимо усиливал образование аппарата p62-PKC δ и, следовательно, фосфорилирование p62.Клетки MCF7 котрансфицировали myc-p62, F-PKC δ и увеличивающимся количеством конструкций V5-Vps34 в течение 48 часов с последующими анализами иммунопреципитации для образования аппарата p62-PKC δ и фосфорилирования p62. ( e ) Удаление Vps34 снижает PKC-δ-зависимое фосфорилирование p62. Myc-p62 с F-PKC-δ или без него котрансфицировали в MCF-7 или Vps34-нокаутные клетки MCF-7 в течение 48 ч с последующим детектированием, как указано.
Неповрежденная структура важна для Vps34-зависимого развития опухоли
Поскольку p62 также является транскрипционным геном-мишенью для Nrf2, он создает петлю положительной обратной связи во время антиоксидантного ответа. 32 Новые данные показывают, что аномальная экспрессия p62 действительно была связана с несколькими видами рака, включая случаи рака простаты, почек, печени, легких, груди и полости рта. 12, 43, 44, 45 Помимо p62 и S349-фосфорилированного p62, мы наблюдали, что уровни экспрессии различных белков, связанных с аутофагией, включая Vps34, LC3 и Nrf2, были положительно связаны с прогрессированием рака, тогда как каспаза 8 была инактивирована в тканях рака молочной железы и ксенотрансплантатах мыши с карциномой MCF-7 (Фигуры 6a и b).Наблюдая эффекты расщепления Vps34 на пролиферацию и инвазию опухолевых клеток in vitro , мы попытались изучить его роль в условиях in vivo и . Клетки MCF-7, стабильно экспрессирующие меченые Vps34, Vps34-ΔD1 и Vps34-Mt (D285E), инокулировали индивидуально в жировые подушечки молочных желез иммунодефицитных мышей с добавкой E 2 для сравнения их общих скоростей роста.
Как показано на рисунках 6c – e, клетки MCF-7, стабильно экспрессирующие помеченные флагом Vps34 или Vps34-Mt, но не Vps34-ΔD1, показали значительное увеличение (более чем в 2 раза) роста опухоли по сравнению с родительскими клетками MCF-7 ( Р <0.01). Как и его экспрессия в тканях рака молочной железы (рис. 6а), каспаза 8 находится в неактивном состоянии в ксенотрансплантатах мыши карциномы MCF-7, а экспрессия LC3, Vps34 и p62 была выше в клетках, экспрессирующих Vps34-Mt, чем в Vps34-Wt. -экспрессирующие клетки. Однако экспрессия ни в клетках, экспрессирующих Vps34-ΔD1, ни в родительских клетках MCF-7 не была выше, чем экспрессия в клетках, экспрессирующих Vps34 дикого типа, в которых развились опухоли (фиг. 6f). В частности, мутация D285E дополнительно увеличивала фосфорилирование Vps34 Raf 1, ERK и MEK, но удаление N-конца отменяло активность Vps34 (фиг. 6f), что согласуется с тем, что ингибирование PI3K приводит к подавлению протеинкиназы MEK / Сигнализация ERK. 46, 47 Фосфорилирование Tyr 340/341 участвует в активации Raf 1, что приводит к фосфорилированию и активации каскада MEK / ERK для роста опухоли.
Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что интактная структура важна для Vps34-зависимого фосфорилирования Raf 1, ERK и MEK, что указывает на активацию Vps34 пути ERK при росте опухоли.
Неповрежденная структура важна для Vps34-зависимого туморогенеза. ( a ) Иммуноблот-анализ лизатов из совпадающих пар тканей рака молочной железы, обозначенных как C, и прилегающих нормальных тканей, обозначенных как N, выполняли с антителами, как указано.( b ) Экспрессия белка, как указано в a , была обнаружена в ткани карциномы после увеличения объема опухоли ксенотрансплантата MCF-7. ( c ) Анализ на онкогенность. Клетки MCF-7 / Vector, MCF-7 / Vps34, MCF-7 / Vps34-ΔD1, Vps34-Mt (D285E) (1,5 × 10 6 ) вводили мышам nude (шесть мышей в группе) отдельно. Измеряли скорость роста опухолей и рассчитывали объемы ( 3 мм) в каждый из указанных дней после инокуляции; каждая точка представляет собой среднее значение (± с.
е.м.) рассчитали объем шести опухолей. Через 35 дней после инокуляции измеряли объемы опухолей ( d ) и фотографировали опухоли ( e ). ( f ) Иммуноблот-анализ лизатов опухолевых тканей в d проводили с антителами, как указано.
Vps34 стимулирует прогрессирование опухоли посредством активации PKC-δ p62 и пути ERK
Для проверки гипотезы о том, что Vps34 способствует прогрессированию опухоли посредством индукции p62, мы создали клетки MCF-7 с нокдауном p62 и MCF-7 с нокдауном p62, стабильно экспрессирующие Vps34 .Эти стабильные клетки и их родительские клетки затем инокулировали иммунодефицитным мышам с добавкой E 2 . В отличие от p62-контролей, у мышей, которые получали короткую шпилечную РНК p62 (shRNA) или клетки, экспрессирующие p62-shRNA-Vps34, развивались опухоли, которые были медленнее по росту и объему, чем у мышей, получавших родительские клетки или клетки, экспрессирующие Vps34 (Фигуры 7a. –C), что указывает на то, что стимуляция роста опухоли Vps34 осуществляется главным образом через p62.
Данные иммуноблоттинга показали, что нокдаун p62 снижает уровни фосфорилирования Raf 1, MEK и ERK, индуцированные сверхэкспрессией Vps34 in vivo (рис. 7d), что указывает на то, что p62 частично участвует в Vps34-зависимой активации пути Raf 1 – MEK – ERK. .Эти данные подтверждают, что p62 необходим для стимулирования онкогенеза Vps34, что согласуется с ролью p62 в онкогенезе. 48, 49
Vps34 стимулирует прогрессирование опухоли посредством активации PKC-δ сигналов p62 и ERK. Онкогенность MCF-7 или MCF-7 / Vps34, стабильно инфицированных лентивирусным контролем или р62 shRNA. Всего 1,5 × 10 6 клеток каждого трансфектанта вводили голым мышам (шесть мышей в группе) отдельно. ( a ) Измеряли скорость роста опухолей и рассчитывали объемы ( 3 мм) в каждый из указанных дней после инокуляции; каждая точка представляет собой среднее значение (± с.Эм. рассчитан объем шести опухолей. Через 35 дней после инокуляции измеряли объемы опухолей ( b ) и фотографировали опухоли мышей ( c ).
( d ) Иммуноблот-анализ лизатов опухолевых тканей в c проводили с антителами, как указано. ( e ) Ras и Rac1 не участвовали в активации Vps34 Raf 1. Выполняли анализ GST-гранул и иммуноблоттинг лизатов из MCF-7 или MCF-7 / Vps34 с антителами, как указано.( f ) PKC-δ является ключевым эффектором в активации Vps34 передачи сигналов p62 и Raf 1. Анализ клеточных лизатов из клеток MCF-7 или MCF-7 / Vps34 и клеток MCF-7 или MCF-7 / Vps34, нокаутированных по PKC-δ, выполняли с антителами, как указано. ( г , ч ) Удаление PKC-δ блокировало Vps34-зависимую онкогенность. На 35-й день после инокуляции были сфотографированы и измерены опухоли от мышей, инокулированных MCF-7 или MCF-7 / Vps34 и нокаутные по PKC-δ клетки MCF-7 или MCF-7 / Vps34. ( i ) Рабочая модель Vps34-зависимой онкогенности.
Для определения механизма активации пути ERK с помощью Vps34, GTP-Ras, GTP-Rac 1 и активный Raf 1 были обнаружены в родительских клетках или клетках, экспрессирующих Vps34.
Данные иммуноблоттинга показали, что механизм активации Vps34 Raf 1 не зависел от GTP-Ras или GTP-Rac (фиг. 7e), что отличается от PI3K класса I. 46, 47 Поскольку Vps34 индуцирует PKC-δ-зависимое фосфорилирование p62, мы стремились проверить, способствует ли Vps34 фосфорилированию Raf 1 посредством PKC-δ. Мы создали клетки MCF-7 с нокаутом по PKC-δ и MCF-7 с нокаутом по PKC, стабильно экспрессирующие Vps34.Данные иммуноблоттинга показали, что удаление PKC-δ снижает уровни фосфорилирования Raf 1, MEK и ERK как в клетках MCF-7, так и в MCF-7, стабильно экспрессирующих Vps34, что согласуется с фосфорилированием p62 на S349 (фиг. 7f). Важно отметить, что устранение PKC-δ изменяет Vps34-зависимую экспрессию Nrf2 и p62. Эти результаты предполагают, что PKC-δ необходим для активации Nrf2 и p62. Чтобы проверить важность Vps34 и PKC-δ в развитии опухоли, Vps34-стабильные клетки MCF-7 и их родительские клетки, а также клетки MCF-7 с нокаутом PKC-δ и клетки MCF-7 с нокаутом PKC, стабильно экспрессирующие Vps34 затем инокулировали иммунодефицитным мышам добавку E 2 .
У мышей, которые получали клетки MCF-7 с PKC-δ-нокаутом или клетки MCF-7, экспрессирующие PKC-δ, развивались опухоли, которые были более медленными по объему, чем у мышей, получавших родительские клетки или клетки MCF-7, экспрессирующие Vps34 (Фигуры 7g и h), что указывает на то, что PKC-δ играет ключевую роль в стимуляции роста опухоли Vps34. Эти наблюдения представляют значительный интерес, учитывая потенциальную важность одновременного ингибирования Vps34 и PKC-δ для контроля путей p62 и MEK / ERK в опухолевых клетках.
PI3K делятся на три класса в зависимости от структуры и предпочтения липидных субстратов. 50 Среди них Vps34 формирует различные комплексы для аппарата аутофагии и эндосомного транспорта, приводя к специфическим локализациям и функциям. 51, 52 Обычно аутофагия существует во многих опухолях, помогая росту и выживанию опухолевых клеток в условиях пищевого и гипоксического стресса во время развития опухоли. Однако наблюдали, что Vps34 индуцировался в ответ на стресс развития опухоли и инициировал создание аутофагосом с более низким уровнем оборота p62 (Фигуры 6a и b).
Это наблюдение предполагает, что потенциальная функция Vps34 не ограничивается путями аутофагии во время развития опухоли.
S349-фосфорилирование в ответ на стресс позволяет p62 связывать Keap1 с более высоким сродством, чем в нефосфорилированном состоянии. 34 Доказательства, которые мы предоставили, подтверждают, что Vps34 имеет внутреннюю функцию, чтобы индуцировать Nrf2-зависимую экспрессию и рекрутировать PKC-δ для S349-фосфорилирования p62. Было показано, что p62 играет важную роль в онкогенезе 35 посредством активации Nrf2-нацеленных онкогенов посредством S349-фосфорилирования.Следовательно, наши результаты подтверждают, что Vps34 играет ключевую роль в прогрессировании опухоли, за исключением своей роли в аппарате аутофагии и перемещении пузырьков. В заключение, повышение Vps34 приводит к прогрессированию опухоли за счет PKC-δ-фосфорилирования p62 по S349, а PKC-δ включает фосфорилирование Raf 1 по Y340 / 341. Основным путем является активация Vps34 генов-мишеней Nrf2 посредством более высокого сродства Keap1 к S349-фосфорилированному p62, а второстепенным путем является PKC-δ-зависимая активация Vps34 Raf 1 для передачи сигналов Raf 1 – MEK – ERK (Рис.