Схема тим 01 принципиальная схема: Электронный таймер ТИМ-01

Недостаточно прав для комментирования

таймер, электронный таймер, ТИМ-01, ТИМ-01Н, принцип работы, электросхема, подключение, проверка, дефекты, ремонт, холодильник, Тольятти, ремонт холодильника, Тольятти, Омск, Томск, Самара, Ульяновск, Новосибирск, Воронеж, Липецк, Барнаул, Нижневартовск, Тюмень, Екатеринбург, Владивосток, Хабаровск, Калуга, Брест, Минск, Киев, Тобольск, Сургут, Ханты-Мансийск, Салехард, Красноярск, Сочи, Новороссийск, Чита, Архангельск, Курган, Уфа, Казань, Москва, Астрахань

Оттайка начинается при условии – температура в морозильной камере не выше – 10 С

Окончание оттайки – при температуре  на термореле  +10 С. Время оттайки зависит от количества инея на испарителе.

Электронный таймер ТИМ- 01Н

Оттайка начинается при условии – температура в морозильной камере не выше – 10 С

Окончание оттайки – при температуре  на термореле  +10С. Время оттайки зависит от количества инея на испарителе

Параметры для проверки:

— ручная установка режима оттайки

— время паузы

— включение холодильного режима

Проверяют в следующей последовательности                                                                                                                                                  

1. При замкнутых контактах теплового реле, когда температура в морозильной камере ниже – 8 (+/- 5 С) ( для реле ТАБ –Т) или – 10 (+\-  3) (для COMBI-100 b 261N), нажимают кнопку таймера. При этом таймер должен перевести систему «NO FROST» в режим оттайки (отключается компрессор и включаются тэны). 

2. Отсоединяют  провод термопредохранителя от коммутационной колодки, тем самым имитируется размыкание контактов теплового реле, после этого если используется таймер ТИМ -01 – компрессор включается через 7 (+\- 3) мин.

 
ТЭУ-01-2 – оттайка электронагревателем, сохранение информации о режиме работы при отключении электропитания в течении 8 часов, продолжительность режима активной оттайки определяется тепловым реле, но не более….

 РВ-1 электронный таймер предназначен для автоматического управления режимом оттайки

Таймер ТИМ-01 холодильника. Режимы. Схема. Ремонт

Электронный таймер оттайки ТИМ-01. Назначение.

Электронный таймер ТИМ-01 применяется для управления оттайкой испарителя холодильников  с системой No Frost, Full No Frost, Total No Frost  холодильников марки Stinol, Indesit, Ariston. Холодильники с системой «NO FROST» отличаются от холодильников со статическим охлаждением тем, что в морозильной камере у них нет статического испарителя,  на полки, которого помещаются продукты. В состав системы входит таймер, испаритель, вентилятор, тэн оттайки и система слива талой воды.

Режимы работы таймера оттайки

Холодильник тёплый, питание отключено

• Если включить питание, двигатель начинает работать. Датчик разморозки (биметалл) находится в разомкнутом состоянии. Началось охлаждение.
• Если температура на испарителе достигает -10 градусов, датчик замыкает цепь. При этом двигатель выключается, включается нагреватель (без паузы), начинается оттайка.
• Если температура на испарителе достигает +10 градусов, датчик размыкает цепь, отключая нагреватель.
• Холодильник «отдыхает» в течение 10 минут (пауза). В некоторых моделях таймеров время паузы может быть гораздо меньше. Например, оно может составлять 1-2 минуты.
• Включается двигатель, начинается рабочий цикл.

Холодильник холодный, питание отключено

• Датчик разморозки находится в замкнутом состоянии. Включаем питание. Начинается оттайка (без паузы), двигатель молчит.
• Температура на испарителе достигает +10 градусов, размыкается датчик. Оттайка прекращается. Пауза 10 минут.
• Включается двигатель, начинается рабочий цикл.

Холодильник тёплый (после оттайки), питание включено (рабочий цикл таймера оттайки)

• Двигатель работает. Если холодильник тёплый, то датчик находится в разомкнутом состоянии.
• Если температура опускается ниже -10 градусов, датчик замыкает цепь. Двигатель продолжает работать, запущен таймер (начался отсчёт времени).
• Как правило, через 8-12 часов (в зависимости от модели таймера) начнётся оттайка (выключится двигатель, включится нагреватель, датчик разомкнёт цепь, пауза 10 минут, и т.д.).
• Если холодильник исправен, то цикл будет повторяться.

Работа кнопки теста таймера оттайки

Если, не дожидаясь 8-12 часов во время рабочего цикла (датчик биметалла должен быть замкнут) нажать кнопку теста таймера, то произойдёт следующее:

1. Двигатель остановится, включится нагреватель.
2. Как правило, при достижении температуры +10 градусов датчик разомкнёт цепь, оттайка прекратится. Пауза 10 минут.
3. Старт двигателя. Начало рабочего цикла.

Схема включения таймера оттайки в холодильнике

В холодильниках B18LFNF, B20DFNF.025, B20FNF.025, B18FNF.025 таймер расположен на задней стенке шкафа над отсеком мотор-компрессора.

• выв. 1 — черный;
• выв. 2- красный;
• выв. 3 — зеленый;
• выв. 4 — белый.

Упрощённо:

Схема включения с двух- и трёхпроводным датчиком

Работа электронного таймера оттайки

Цикл оттайки  — через 8, 12 часов работы компрессора (время стоянки не учитывается)

Оттайка начинается при условии – температура в морозильной камере не выше – 10 С

Окончание оттайки – при температуре  на термореле  +10 С. Время оттайки зависит от количества инея на испарителе.

При первом включении холодильника, при достижении температуры  в морозильной камере  -10 С, таймер входит в режим оттайка – используется для контроля работы системы оттайки.

Оттайка начинается при условии – температура в морозильной камере не выше – 10 С

Окончание оттайки – при температуре  на термореле  +10С. Время оттайки зависит от количества инея на испарителе.

Параметры для проверки:

• ручная установка режима оттайки
• время паузы
• включение холодильного режима

Проверка таймера в следующей последовательности

1. При замкнутых контактах теплового реле, когда температура в морозильной камере ниже – 8 (+/- 5 С) ( для реле ТАБ –Т) или – 10 (+\-  3) (для COMBI-100 b 261N), нажимают кнопку таймера. При этом таймер должен перевести систему «NO FROST» в режим оттайки (отключается компрессор и включаются тэны).
2. Отсоединяют  провод термопредохранителя от коммутационной колодки, тем самым имитируется размыкание контактов теплового реле, после этого если используется таймер ТИМ -01 – компрессор включается через 7 (+\- 3) мин.
3. После этого восстанавливают целостность схемы холодильника. При необходимости заменяют дефектный таймер.

Схема проверки таймера холодильника Indesit, Ariston ТИМ-01

Алгоритм проверки таймера

Ремонт таймера ТИМ-01 холодильников NoFrost

Часто таймер оттайки типа ТИМ-01 на микросхеме с маркировкой «ХМ3» можно вернуть к полноценной жизни.

Если плата вашего неисправного таймера выглядит как на фото и все детали исправны, а сигнал на включение оттайки с выхода 3 микросхемы ХМ3 не поступает, скорее всего, в обрыве коллекторный резистор.

Внешний резистор номиналом от 4.7кОм до 5.1 кОм с 8-й ножки на 3-ю излечивает дефект микросхемы.

По-видимому, она КМОП логики и не рассчитана на подключенный к её выходу 3 резистор 1 кОм.

Схема электронного таймера оттайки ТИМ-01

Если выход 3 помер окончательно и бесповоротно, выход 2 этой же микросхемы имеет инверсный сигнал и его тоже можно использовать.

Более 10-ка восстановленных таким образом таймеров исправно работают уже несколько лет.

Если неисправные таймеры ТИМ-01 на «Аttiny13» со сгоревшим контроллером, то такие девайсы, обычно не ремонтируются.

• Какую газовую колонку выбрать?

Если в доме есть газ, значит, есть возможность сделать так, чтобы из кранов постоянно текла горячая вода. Эта задачу можно решить несколькими способами, но наиболее простой – купить водонагреватель проточный газовый, который в народе именуется просто – газовая колонка.

Это достаточно простое устройство, которое греет воду с помощью горелки. Причем, нагревает ее до нужной температуры практически сразу же после включения. Если учесть, что способы розжига этого устройства очень удобные, а размеры небольшие, то остается только определиться с необходимой мощностью.  Подробнее…

• Надувная лодка: правильная эксплуатация и ремонт

Использование лодки в водоёме — это всегда опасно! Перед тем как отправиться в плавание на лодке необходимо ознакомиться с некоторыми правилами безопасности, с самой лодкой и водоёмом, в которым вы собрались плавать. Рекомендуется надеть на себя и если есть пассажиры, то и на них спасательные жилеты.

Подробнее…

• Как быстро и бесплатно разблокировать WINDOWS

Помощь в разблокировке Windows от Trojan.

Winlock Услуга предназначена для бесплатной разблокировки операционной системы Windows от вредоносной программы Trojan.Winlock и предоставляется совместно с Dr.Web. Подробнее…

Популярность: 2 798 просм.

Тим 01 схема подключения по цветам – 4apple – взгляд на Apple глазами Гика

ремонт NoFrost таймера холодильников Stinol, Indesit, Ariston

Электронные таймеры оттайки можно условно разделить на 2 большие группы –
ТИМ-01 на микросхеме с маркировкой «ХМ3» и ТЭУ-01 на «Аttiny13»

Понятно, что замена перегоревших резисторов или залипшей кнопки не тема для статьи.
Хочу поделиться способом оживления именно микросхем таймера.

И если неисправные таймеры на «тиньке» со сгоревшим контроллером, как правило, отправляются сразу в мусор,
то часто таймер оттайки типа ТИМ 01 можно вернуть к полноценной жизни.

Если плата вашего неисправного таймера выглядит вот так (фото с Монитора):

И все детали исправны, а сигнал на включение оттайки с выхода 3 микросхемы ХМ3 не поступает,
скорее всего, в обрыве коллекторный резистор.

Внешний резистор номиналом от 4.7кОм до 5.1 кОм с 8-й ножки на 3-ю излечивает дефект микросхемы.

По-видимому, она КМОП логики и не рассчитана на подключенный к её выходу 3 резистор 1 кОм.

Более 10 шт восстановленных таймеров исправно трудятся уже 2 года.

Рассмотрим холодильники фирмы Индезит, Аристон с системой «no frost». Что в переводе на русский означает «нет инея». Особенность этой серии холодильников в наличии принудительной системы оттайки испарителя. Для этой цели рядом с испарителем находится отогревающий тэн, который включается с периодичностью заданной таймером оттайки.

Начальное положение системы на схеме соответствует температуре в камерах холодильника +20 С. Или можно сказать, что холодильник давно не включали.
Падаем в систему питание, для чего выводим терморегулятор в крайне правое положение. Напряжение через замкнутые контакты терморегулятора приходит к мотору компрессора ( МК ). Другой потенциал запитывает мотор через нормально замкнутые контакты 2 и 3 таймера ТИМ-01.
Компрессор начинает нагнетать хладагент в систему. На этом этапе вы не сумейте проверить систему разморозки, тестовой кнопкой реле ТИМ-01.
Причина этого очень простая, на самом реле в этот момент нет питания. Примерно через минут 10-15 температура на испарителе опустится до нужных нам – 8 градусов. Реле ТАБ-Т-1 замкнёт свои контакты и через тэн подаст питание на таймер ТИМ-01. Таймер начнёт отчитывать время работы компрессора. Вот тут уже можно запустить принудительный цикл разморозки с тестовой кнопки реле ТИМ-01. Если спираль тэна оборвана то напряжение на таймере не появится, соответственно принудительный тест системы оттайки не включится.
При запуске теста, таймер переключит свои контакты, разорвет питание компрессора и замкнёт группу контактов 3 и 4, подав питание на тэн испарителя.
В этот момент само реле ТИМ-01 питается через обмотку двигателя компрессора и продолжает удерживать тэн под напряжением.
По достижении температуры испарителя +11 градусов тепловое реле ТАБ-Т-1 снова размыкается. Таймер ТИМ-01через 1 контакт обнаруживает размыкание контактов термовыключателя и переходит в начальную позицию. Компрессор снова включается и начинается цикл заморозки. При рабочем цикле таймер ожидает 2 минуты между выключением тэна и включением компрессора.
В непрерывном цикле работы таймер постоянно считает время работы компрессора.
Время простоя он считать не может, так как при разомкнутых контактах терморегулятора на него не поступает питание. В паузах работы компрессора, таймер сохраняет свои показания в памяти. Затем при появлении питания снова считывает сохранённые значения и продолжает дальше отсчитывать время работы компрессора.
Через каждые 8 часов работы компрессора таймер переключается на режим оттайки испарителя.
Вторые контакты в тепловом реле ТАБ-Т-1 являются аварийными и срабатывают при перегреве в камере испарителя выше 72 градусов. После сработки аварийных контактов, термореле ТАБ-Т-1 не восстанавливается и становится непригодным для дальнейшего использования.
По той же схеме что приведена выше, собирается небольшой проверочный стенд для тестирования циклов работы таймера оттайки.

Роль нагревательного тэна и мотора компрессора выполняют две лампы накаливания на 40 ватт с патронами Е-14. Контактная колодка под таймер изготавливается их стандартных клемм, расположенных в правильной позиции и залитых компаундом. Имитацию работы теплового реле производят обычным выключателем. Терморегулятор при необходимости имитируется отключением сетевой вилки прибора . Плюс здесь в том, что проверка таймера на стенде производится довольно быстро, в отличии от проверки на самом холодильнике. Что значительно экономит драгоценное время мастера.
Холодильники «no frost» фирмы Индезит, Аристон могут комплектоваться другими таймерами и тепловыми реле. Однако принцип работы всей системы, остаётся прежним.

основная задача устранить проблемы в работе вашего холодильника качественно, в кратчайший срок и по приемлемой цене

• Главная
• электронный таймер ТИМ-01

электронный таймер ТИМ-01

3. После этого восстанавливают целостность схемы холодильника. При необходимости заменяют дефектный таймер
Индезит NBA18FNF Индезит C132NFQ.016

ТИМ-01С

ТЭУ-01-2 – оттайка электронагревателем, сохранение информации о режиме работы при отключении электропитания в течении 8 часов, продолжительность режима активной оттайки определяется тепловым реле, но не более.

РВ-1 электронный таймер предназначен для автоматического управления режимом оттайки

Холодильники с системой No Frost — Ремонт холодильников — Каталог статей

Холодильники с системой NO FROST отличаются от холодильников со статическим охлаждением тем, что в морозильной камере у них нет статического испарителя, на полки, которого помещаются продукты. Конструкция в бытовой холод пришла из торгового, коммерческого холодильного оборудования, где вопрос разморозки испарителя холодильной машины и повышения эффективности охлаждения встал раньше и острее. В состав системы входит таймер, испаритель, вентилятор, тэн оттайки, тепловое реле тэна и система слива талой воды.

Испаритель «NO FROST», представляет из себя радиатор и располагается в верхней или в нижней части морозильной камеры, или за панелью задней стенки камеры. За испарителем устанавливается вентилятор, который прогоняет воздух морозильной и холодильной камер через испаритель.

Для сохранения эффективности охлаждения воздуха из-за низкой теплопроводности слоя инея, необходимо время от времени производить оттайку испарителя. Оттайка начинается по команде таймера и происходит под действием тепла, вырабатываемого тэном, установленным на испарителе.

Cодержание статьи

1. Принципиальная электрическая схема холодильника с системой «No Frost».
2. Холодильники с системой FROST FREE.

Принципиальная электрическая схема холодильника с системой «No Frost»

При включении холодильника в сеть, контакты терморегулятора «3» — «4» замкнуты, через терморегулятор подается напряжение на компрессор, вентилятор обдува испарителя, вентилятор запитан параллельно с компрессором и работает пока работает компрессор, отключаясь при открытии двери.

Оттайка происходит при условии — температура на термореле, закрепленном на испарителе – 10 С, таймер отключает вентилятор и компрессор (контакты «2» — «3» таймера) и подает напряжение на тэн испарителя контакты «3»-«4».

При наборе температуры +10 С на термореле, таймер размыкает контакты на тэн, и замыкает контакты «2»-«3» компрессора, холодильник переходит в режим «охлаждение». Периодичность оттайки задается таймером и в зависимости от конструкции холодильника, составляет 6, 8, 12 часов непрерывной работы компрессора (время остановки не учитывается).

Если на холодильнике установлен технологический таймер — применяется для тестирования работы системы «No Frost», то при выключении холодильника из сети, последующее включение будет начинаться с оттайки испарителя. При наборе холодильником заданной температуры, размыкаются контакты «3»-«4», отключается компрессор, вентилятор.

При повороте ручки терморегулятора против часовой стрелки в крайнее положение, размыкаются контакты «6»-«3» терморегулятора, выключается компрессор, вентилятор.

Испаритель холодильника Индезит NBA18FNF затянут льдом в результате дефекта системы оттайки — теплового реле тэна испарителя, в результате чего не подается напряжение на тэн, повышается температура в морозильной камере, затягивает инеем канал подачи охлажденного воздуха в холодильную камеру (расположен за испарителем). Нет охлаждения в холодильной камере

Холодильники с системой FROST FREE

В холодильниках с системой FROST FREE, испаритель охлаждает только морозильную камеру, в холодильной камере установлен «плачущий» испаритель.

Количество влаги, вымерзающей на испарителе в морозильной камере меньше и оттайку производят каждые 12, часов работы компрессора (время остановки компрессора при отключении холодильника, по достижении заданной температуры сюда не входит).

По исполнению таймеры различают на электромеханические и электронные. Электромеханический таймер Стинол (морозильные камеры «No Frost» моделей 102, 106, «Frost Free» моделей 104, 107, 117).

Электронный таймер ТИМ- 01 (чаще встречается в моделях с охлаждением морозильной и холодильной камеры от одного испарителя).

Технические характеристики и принципиальная схема «Стинол 107»

Общие характеристики холодильника «Стинол-107»

Тип: холодильник с морозильником 

Расположение: отдельно стоящий 

Расположение морозильной камеры: снизу 

Материал покрытия: пластик 

Управление: электромеханическое 

Энергопотребление: класс C  

Количество компрессоров: 1 

Количество камер: 2 

Количество дверей: 2 

Габариты (ШxГxВ): 60x60x167 см 

Размораживание морозильной камеры: No Frost 

Размораживание холодильной камеры: капельная система 

Мощность замораживания: до 4.5 кг / cутки 

Минимальная температура в морозильной камере: -18 °C 

Дополнительные возможности: суперзаморозка 

Общий объем: 280 л 

Объем холодильной камеры: 200 л 

Объем морозильной камеры: 80 л 

Материал полок: металл 

В комплекте: 2 выдвижных ящика и 2 формочки для льда; 4 полки, 3 из них переставляемые по высоте, 2 непрозрачных контейнера для овощей и фруктов, полочки на внутренней стороне дверцы с системой «мультибокс». 

Принципиальная схема электрооборудования   «Стинол-107»

L — Фаза

N — Нейтраль

ТН1 — терморегулятор

Rh2 — тепловое реле компрессора

RA1 — пусковое реле компрессора

SL1 — индикаторная лампа

IL1 — выключатель лампы освещения холодильной камеры

L1 — лампа освещения холодильной камеры

TIM — таймер

TR — тепловое реле электронагревателя испарителя

IMV — выключатель вентилятора

MV — вентилятор

TF — тепловой плавкий предохранитель

CO1 — компрессор

R1 — электронагреватель испарителя

R2 — электронагреватель поддона испарителя

Вариант схемы холодильника «Стинол-107ER», представленный в технической заводской документации 2000 года

М — электродвигатель вентилятора

SK1 — терморегулятор

КТ — таймер

КК, SК — реле тепловое с термовыключателем

SB1, SB2 — выключатель кнопочный

СО — компрессор

HLG — лампа индикаторная

ЕL — лампа освещения

ЕК1 — нагреватель испарителя

ЕК2 — нагреватель поддона каплепадения

На схеме условно показано:

• Положение контактов кнопочных выключателей SB1, SB2 — при открытых дверях морозильной и холодильной камер.
• Положение термочувствительных контактов терморегулятора SK1 — при достижении температуры отключения. 

Схема холодильного агрегата  «Стинол-107»

1 — компрессор

2 — нагнетательный трубопровод

3 — конденсатор

4 — фильтр-осушитель

5 — капиллярная трубка

6 — испаритель холодильной камеры

7 — испаритель морозильной камеры

8 — всасывающий трубопровод

Ремонт холодильников «Стинол 107»

Все мастера по ремонту холодильников, работающие в нашей компании, обладают многолетним опытом. Большинство из сотрудников «ПластХладо» занимаются ремонтом холодильного оборудования свыше 10 лет. За годы своей профессиональной деятельности каждый из них сотни раз успешно проводил ремонт именно холодильников «Стинол», так как эта марка является одной из самых популярных в нашей стране. Также у нас всегда в наличии качественные запчасти для холодильников и всё необходимое оборудование для ремонтных работ. Поэтому мы можем с уверенностью утверждать: если у вас сломался холодильник Stinol 107, то в 99 случаях из 100 мы сможем его починить в день обращения.

Более подробно:

Индезит Full No Frost

Компания Indesit, как и другие ведущие производители холодильников, выпускает модели с системой Full No Frost. Вот некоторые модели холодильников Indesit с системой Full No Frost:
Indesit B16FNF, BA18FNF, B20FNF.025, Ariston RMB1200F и др.

…

Посмотреть ролик Indesit FNF

Схема холодильника с системой full no frost:

На схеме no frost:
SB1 — выключатель сети, SB2 — кнопка открывания двери ХК, SK — терморегулятор, КТ — таймер, L1 — лампа освещения ХК, Н1 — индикатор сети, Super — индикатор режима суперзаморозки, Fan — вентилятор, Compressor — компрессор холодильника, Т — термореле, R — нагреватель оттайки.
Цикл работы холодильника Индезит FNF:
При включении холодильника в сеть через замкнутые контакты сетевой кнопки и терморегулятора запускается компрессор и вентилятор в морозильной камере, причем вентилятор работает даже при открытой двери морозильного отсека. После набора температуры в минус 10 град. С. на термореле, таймер отключает вентилятор и компрессор размыканием контактов 2-3 на таймере и замыкает цепь нагревателя испарителя через контакты 3-4. Идет нагрев испарителя и оттаивание снеговой шубы.

При достижении температуры плюс 10 град. С на термореле (время оттайки зависит от количества снеговой шубы на испарителе), происходит обратное переключение контактов на таймере, на цепь вентилятора и компрессора (контакты 2-3). После первого цикла оттайки таймер отсчитывает 8 часов работы компрессора (без учета стоянок компрессора) и цикл оттайки повторяется. Если в этот период будет отключена электроэнергия, то таймер начнет цикл с разморозки испарителя.
В системе Full No Frost возможно использование как механического, так и электронного таймера. Применяемые таймеры: РВ-1, ТИМ-01, ТИМ-01Н.
Возможные неисправности холодильников full no frost:
Нет охлаждения в холодильной камере, канал подачи воздуха в холодильную камеру перекрыт снеговой шубой — неплотное прилегание двери холодильной камеры, слишком низкая температура срабатывания термореле Т (ниже -10 град.С), неплотное прилегание прокладки на воздушной заслонке в ХК.
В большинстве случаев можно выполнить на дому.

Схема и описание аппарата TNO TIM-1 в липиде …

Контекст 1

… дано сравнение различных стандартных рабочих условий для TNO TIM-1 в диализной и липидной конфигурациях мембран. в таблице I, а схема и описание установки липидной мембраны TIM-1 показаны на рис. 1. Параметры, не указанные в таблице I, идентичны для двух конфигураций. Цель этого отчета — начать систематическое исследование того, может ли система TNO TIM-1 в конфигурации липидной мембраны использоваться для поддержки фармацевтических разработок плохо растворимых соединений.С этой целью в данной первоначальной публикации рассматривается использование TIM-1 для …

Контекст 2

… данные из системы TIM-1 будут сравниваться с данными фазы 1 клинического воздействия для того же соединения. . В тех случаях, когда доклинический профиль безопасности соединения не поддерживает его дозирование здоровым добровольцам, например, часто тем, которые предназначены для лечения рака, система TIM-1 может быть особенно полезной для поддержки разработки соединения в качестве любого клинического фармакокинетика. Оценка рецептуры должна проводиться у пациентов, у которых возникают многочисленные вопросы этического, логистического и временного характера.Было предсказано, что выбранное тестируемое соединение, AZD8055, будет иметь менее чем пропорциональное дозе увеличение экспозиции при высоких дозах (> 300 мг) из-за ограниченной растворимости абсорбции. Исследование TIM-1 было начато для оценки возможности нелинейного воздействия простого раствора с отрегулированным pH (10 мг / мл) AZD8055 в дозах 200 и 500 мг при стандартных условиях натощак. Состав в виде суспензии, представляющий состав таблетки «в лучшем случае» (т.е. таблетка с мгновенным распадом и диспергированием), также был испытан в тех же дозах, чтобы оценить риск будущего перехода состава на твердую лекарственную форму.Кроме того, суспензию 200 мг обрабатывали в ахлоргидных условиях (желудочный pH 5) с быстрым опорожнением желудка (t 20 мин) для оценки возможности вариабельности in vivo в результате чувствительной к pH растворимости этого соединения. Фумарат AZD8055 также оценивали как потенциальную стратегию смягчения последствий плохой работы, выявленной в любом из вышеупомянутых условий. AZD8055 является слабым основанием с p K a, равным 6,2, и log D 7,4, равным 3,2. Таким образом, соединение показало большую растворимость в кислой среде (13 мМ в искусственной желудочной жидкости при pH 1.7) по сравнению с кишечной средой (17 мкМ в фосфатном буфере pH 6,8). Основываясь на прогнозируемой эффективной дозе (325 — 3325 мг два раза в день), AZD8055 был классифицирован как «низкая растворимость» в соответствии с Системой классификации биофармацевтики (BCS) (19). Растворимость была немного улучшена (71 мкМ) в аспирированной кишечной жидкости человека и в жидкости, имитирующей тонкий кишечник натощак, при pH 6,5 (39 мкМ) из-за присутствия компонентов желчи. Проницаемость кишечника была признана высокой на основании методов культивирования эпителиальных клеток in vitro (MDCK, Caco 2), что дало общую предварительную классификацию BCS 2.Если не указано иное, реагенты были поставлены компанией Sigma-Aldrich Company Ltd, Дорсет, Великобритания. Свиная желчь (Hendrix Slaughter House) и панкреатин (панкреатический фермент для кошек и собак, 250 г Tub, Pfizer Animal Health) были предоставлены TNO, Zeist, NL. Трифторуксусная кислота была поставлена ​​Alfa Aesar, MA, США. Липаза (липаза Rhizopus F-AP 15) была предоставлена ​​Amano Pharmaceuticals, Chipping Norton, Oxfordshire, UK В каждом из четырех отсеков есть датчик pH для автоматического измерения pH раствора в этом отсеке (см.рис.1). Компьютер может управлять заданной кривой pH, выделяя либо воду, либо 1 M HCL в желудок, либо воду или 1 M NaHCO 3 в двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку. Система TIM-1 была запущена в конфигурации «липидной мембраны» с использованием микрофильтрации в качестве технологии разделения для имитации абсорбции растворенного / солюбилизированного лекарственного средства. Насос фильтрата был установлен на 3,9 мл / мин, что обеспечивает пограничное состояние « высокой проницаемости » (выводится из того факта, что ~ 80% легко растворимого соединения будет « абсорбировано » в ходе эксперимента при этом потоке). оцените, см. «Обсуждение»).Все эксперименты в настоящем исследовании проводились в условиях голодания, когда параметры среды и машины были настроены так, чтобы имитировать состояние голодания. Все рабочие растворы готовятся в день использования. Все растворы производятся на деионизированной воде, если не указано иное. В желудочном отсеке начальная среда желудочного сока натощак, содержащая: 202 мг хлорида натрия, 72 мг хлорида калия, 39 мг бикарбоната натрия и 10 мг дигидрата хлорида кальция, 0,01 М цитратный буфер pH 7, липазу (37,5 единиц) и пепсин (600 ед.). единицы).Требуемая корректировка pH (до pH 2 или 5) была произведена с использованием 1 M HCl и доведена до 300 г с питьевой водой, что соответствует объему воды, потребляемой пациентом во время дозирования. Двенадцатиперстная кишка и тощая кишка содержат приблизительно 60 и 120 г, соответственно водного раствора, содержащего 1,25 г / л хлорида натрия, 0,15 г / л хлорида калия и 0,075 г / л дигидрата хлорида кальция, 3,5 г / л панкреатина и 10% мас. / мас. желчи. В подвздошной кишке содержится 120 г водного раствора, содержащего 5,0 г / л хлорида натрия, 0.6 г / л хлорида калия и 0,30 г / л дигидрата хлорида кальция. Образцы были собраны через 60, 120, 180, 240, 300 и 360 минут из трех точек и проанализированы на AZD8055: жидкость, которая выходит из подвздошной кишки («эффлюент», аналогичный лекарственному средству, которое будет попадать в толстую кишку и предположительно не поступает. быть доступным для абсорбции), а также фильтрата тощей кишки и подвздошной кишки (аналог растворенного и проникающего лекарственного средства, которое попадает в системный кровоток, вместе известных как «биодоступная фракция»).Весь объем за каждый период отбора проб собирали, взвешивали, отбирали пробы и разбавляли равным объемом ацетонитрила для последующего анализа. В конце эксперимента остаточная жидкость, оставшаяся в отсеках TIM-1, была собрана и проанализирована на AZD8055. Отделения дополнительно промывали и анализировали промывки на AZD8055. Концентрацию AZD8055 в среде TIM-1, остаточной жидкости и смывах, разбавленных равным объемом ацетонитрила (для осаждения белка и обеспечения растворения отфильтрованного лекарственного средства), определяли методом ВЭЖХ с использованием системы ВЭЖХ Agilent 1100 (Agilent Technologies, Inc, Калифорния, США) и Luna C18 (2) 3 мкм 4.Колонка 6 × 50 мм (Phenomenex, Калифорния, США) и градиентное элюирование с подвижной фазой, состоящей из воды, ацетонитрила и 0,1% об. / Об. Трифторуксусной кислоты. Концентрации AZD8055 количественно сравнивали со стандартами известной концентрации по УФ-поглощению при 254 нм. Исследование TIM-1 проводилось в четыре этапа для оценки …

% PDF-1.3 % 1 0 объект > поток конечный поток эндобдж 2 0 obj > эндобдж 6 0 obj > / Rect [67.26 692,78 527,94 706,88] >> эндобдж 7 0 объект > / Rect [67,26 660,8 527,94 674,84] >> эндобдж 8 0 объект > / Rect [123,96 641,48 527,94 654,62] >> эндобдж 9 0 объект > / Rect [123,96 624,14 527,94 636,32] >> эндобдж 10 0 obj > / Rect [123,96 607,16 527,94 619,34] >> эндобдж 11 0 объект > / Rect [123,96 588,44 527,94 601,58] >> эндобдж 12 0 объект > / Rect [123,96 569,48 527,94 582,62] >> эндобдж 13 0 объект > / Rect [123,96 550,46 527,94 563,6] >> эндобдж 14 0 объект > / Rect [123,96 531.44 527,94 544,58] >> эндобдж 15 0 объект > / Rect [123,96 512,48 527,94 525,62] >> эндобдж 16 0 объект > / Rect [123,96 493,46 527,94 506,6] >> эндобдж 17 0 объект > / Rect [123,96 474,44 527,94 487,58] >> эндобдж 18 0 объект > / Rect [123,96 455,48 527,94 468,56] >> эндобдж 19 0 объект > / Rect [67,26 423,8 527,94 437,84] >> эндобдж 20 0 объект > / Rect [123,96 404,48 527,94 417,56] >> эндобдж 21 0 объект > / Rect [123,96 385,46 527,94 398,6] >> эндобдж 22 0 объект > / Rect [123,96 366,44 527.94 379,58] >> эндобдж 23 0 объект > / Rect [67,26 334,82 527,94 348,86] >> эндобдж 24 0 объект > / Rect [123,96 315,44 527,94 328,58] >> эндобдж 25 0 объект > / Rect [123,96 296,48 527,94 309,56] >> эндобдж 26 0 объект > / Rect [123,96 277,46 527,94 290,6] >> эндобдж 27 0 объект > / Rect [123,96 260,12 527,94 272,3] >> эндобдж 28 0 объект > / Rect [123,96 243,14 527,94 255,32] >> эндобдж 29 0 объект > / Rect [123,96 226,1 527,94 238,28] >> эндобдж 30 0 объект > / Rect [123,96 209,12 527,94 221.3] >> эндобдж 31 0 объект > / Rect [67,26 177,8 527,94 191,84] >> эндобдж 32 0 объект > / Rect [67,26 145,76 527,94 159,86] >> эндобдж 33 0 объект > / Rect [123,96 126,44 527,94 139,58] >> эндобдж 34 0 объект > / Прямоугольник [74,76 86,66 84,78 97,94] >> эндобдж 5 0 obj > / ProcSet [/ PDF / Text] / ColorSpace> / Font> / Свойства >>> эндобдж 4 0 obj > поток hZY7 ~ ׯ #; (

Функциональные ВПЧ-специфические PD-1 + стволовые CD8 Т-клетки при раке головы и шеи

Документы | Rain Bird

Добро пожаловать

Добро пожаловать в интерактивный тур CirrusIC! Мы покажем вам некоторые захватывающие новые функции в CirrusIC .

1 из 12

Приборная панель

Настраиваемая приборная панель CirrusIC была разработана с нуля для наших пользователей.Интерактивная карта позволяет быстро просматривать состояние всех станций и ориентироваться на любые интересующие области. Панель управления — это ваша персонализированная целевая страница, которая дает вам всю необходимую информацию с первого взгляда.

2 из 12

Быстрый доступ

На панели инструментов быстрого доступа вы сможете выполнять самые обычные действия всего одним щелчком мыши. Хотите управлять своими программами? Просто нажмите ПРОГРАММЫ . Давай, щелкни по нему.

3 из 12

Программы

Страница ПРОГРАММЫ дает вам обзор всех ваших программ и деталей программ.Добавление, редактирование и настройка программ еще никогда не были такими простыми.

4 из 12

Добавить программу

Хотите добавить новую программу? Наша кнопка QUICKIRR ™ позволяет быстро настраивать простые или сложные программы. Нажмите кнопку QUICKIRR ™ , чтобы увидеть его в действии.

5 из 12

Конфигурация

Быстро создайте программу полива, внесите изменения и многое другое. Создание новых программ интуитивно понятно, просто и быстро!

6 из 12

Добавить станции

Наша технология QUICKIRR ™ используется в CirrusIC .Добавление новых станций происходит молниеносно и очень просто.

7 из 12

Batch-Edit

Вам нужно отредактировать несколько программ или других элементов? CirrusIC доставляет. Просто выберите все элементы, которые вы хотите отредактировать, нажмите кнопку «Редактировать» и выберите настройки, которые вы хотите изменить. Нажмите «ГОТОВО», и все выбранные вами программы будут обновлены.

8 из 12

Предупреждения

CirrusIC предупреждает вас о проблемах до их возникновения! Диагностика постоянно выполняется в фоновом режиме, проверяя признаки потенциальных проблем и автоматически предоставляя вам результаты.Нет необходимости самостоятельно проверять уровни напряжения или другие параметры. CirrusIC сделает это за вас и предупредит вас, когда что-то требует вашего внимания.

9 из 12

Персонализация

Сделайте CirrusIC по-настоящему вашим. Настройте параметры для каждого пользователя, включая уровень доступа, единицы измерения, язык и многое другое!

10 из 12

Уникальных для каждого пользователя

На этом настройка не заканчивается. Вернувшись на панель инструментов, все полностью настраивается для каждого пользователя.Поместите важную для вас информацию в центр внимания. Измените его в любое время по мере необходимости.

11 из 12

Что дальше?

Вы видели лишь несколько функций, которые может предложить CirrusIC. CirrusIC — это кульминация опыта Rain Bird, ее технологий и особой направленности на то, чтобы предоставить вам решение централизованного управления, о котором вы просили. Нажмите ниже, чтобы увидеть полную демонстрацию того, как CirrusIC заново изобретает Central Control.

12 из 12

Парадокс тренировки и предотвращения травм: должны ли спортсмены тренироваться умнее и усерднее?

Взаимосвязь между тренировкой и эффективностью

В блоге British Journal of Sports Medicine доктор Джон Орчард1 предложил гипотетические взаимосвязи между тренировками (как недогрузкой, так и перетренированностью), травмой, физической подготовкой и производительностью.Он предположил, что как неадекватные, так и чрезмерные тренировочные нагрузки приведут к увеличению травм, ухудшению физической формы и плохой командной работе (см. Рисунок 1). Взаимосвязь между тренировочной нагрузкой, травмой, физической подготовкой и производительностью имеет решающее значение для специалистов по спортивной медицине / физиотерапии и спортивной науке. В этой статье я использую термин «практикующие» для обозначения широкого круга специалистов в области здравоохранения, а также ученых в области спорта, которые работают со спортсменами / командами (например, тренеров по силовой и физической подготовке, сертифицированных персональных тренеров и т. Д.).Наша область — спортивные результаты и профилактика спортивных травм — носит междисциплинарный характер, и этот документ имеет большое значение для этой области.

Гипотетическая взаимосвязь между тренировочными нагрузками, физической подготовкой, травмами и производительностью. Повторно из Orchard.1

Травмы ухудшают работу команды, но любые травмы, которые потенциально могут рассматриваться как «связанные с тренировочной нагрузкой», обычно рассматриваются как «предотвратимые» и, следовательно, являются прерогативой команды спортивной науки и медицины. Специалисты в области спортивной науки (включая силу и кондиционирование) и спортивной медицины (включая врачей и физиотерапевтов) преследуют общую цель — защитить игроков от травм.Специалисты по спортивной науке, силовой и физической подготовке стремятся развить жизнестойкость, подвергая игроков физически интенсивным тренировкам, чтобы подготовить игроков к физическим требованиям соревнований, включая самые сложные этапы игры.

С другой стороны, врачи и физиотерапевты часто рассматриваются как персонал, ответственный за «управление игроками на безопасном расстоянии от травм». Стереотип — это физиотерапевт или врач, выступающий за снижение тренировочных нагрузок, чтобы меньше игроков подвергалось травмам, «связанным с нагрузкой» (например, чрезмерной нагрузкой).Однако сколько решений, определяющих игроков и их индивидуальные тренировочные нагрузки, основано на эмпирических данных или «экспертной» интуиции практикующих (т. Е. На «интуиции»)?

Банистер и др. 2 предположили, что результативность спортсмена в ответ на тренировку можно оценить по разнице между отрицательной функцией («утомляемость») и положительной функцией («фитнес»). Идеальный тренировочный стимул — это «сладкое пятно», которое максимизирует чистый потенциал производительности за счет соответствующей тренировочной нагрузки, ограничивая при этом негативные последствия тренировки (например, травмы, болезни, усталость и перетренированность).3

В нескольких исследованиях изучалось влияние объема, интенсивности и частоты тренировок на спортивные результаты, при этом показатели обычно улучшались с увеличением тренировочной нагрузки. 4–10 В отдельных видах спорта (например, плавание и бег) больший объем тренировок, 4, 8 и более высокая интенсивность тренировок5, 6, 8 улучшили производительность. В исследовании 56 бегунов, велосипедистов и конькобежцев, которые тренировались в течение 12 недель, 10-кратное увеличение тренировочной нагрузки было связано с примерно 10% улучшением результатов.10 У пловцов, участвующих в соревнованиях, была обнаружена значимая связь между большим объемом тренировок (r = 0,50–0,80) и более высокой интенсивностью тренировок (r = 0,60–0,70) и улучшением результатов. 9 Однако побочные эффекты тренировок с физической нагрузкой также связаны с дозой. самая высокая частота заболеваний и травм возникает, когда тренировочные нагрузки были самыми высокими.10–15

Тренировочные нагрузки можно измерить разными способами

Спортивные ученые обычно получают измерения предписанной внешней тренировочной нагрузки (т. е. физической «работы»), сопровождается внутренней тренировочной нагрузкой (то есть физиологической или перцепционной «реакцией»).Внешние тренировочные нагрузки могут включать в себя общую дистанцию ​​бега, поднятый вес или количество и интенсивность спринтов, прыжков или столкновений (и это лишь некоторые из них) .16 Внутренние тренировочные нагрузки включают оценки воспринимаемой нагрузки и частоты сердечных сокращений. Индивидуальные характеристики спортсмена (например, хронологический возраст, тренировочный возраст, история травм и физические возможности) в сочетании с приложенными внешними и внутренними тренировочными нагрузками определяют результат тренировки.16

Например, идентичные внешние тренировочные нагрузки могут вызывать значительно разные внутренние тренировочные нагрузки у двух спортсменов с существенно разными индивидуальными характеристиками; тренировочный стимул может быть подходящим для одного спортсмена, но неподходящим (слишком высоким или слишком низким) для другого.Мужчина среднего возраста с избыточным весом будет иметь очень разные физиологические и перцепционные реакции на усилие на 800 м, чем тренированный бегун. Несмотря на то, что внешняя тренировочная нагрузка идентична, внутренняя тренировочная нагрузка будет намного выше у более старшего, не подготовленного человека! Поскольку доза-реакция на тренировку варьируется от человека к человеку, тренировку следует назначать индивидуально.

Внешняя тренировочная нагрузка — «отслеживание» каждого метра!

Глобальные системы позиционирования (GPS) изменили правила игры в мониторинг внешних нагрузок.17 Эти устройства, которые обычно не больше мобильного телефона, носят спортсмены во время тренировок и матчей. GPS предоставляет информацию о скорости и пройденных расстояниях, в то время как инерционные датчики (например, акселерометры, гироскопы), встроенные в устройства, также предоставляют информацию о нелокомоторных видах спорта (например, прыжки в волейболе, столкновения в регби и гребки в плавании). 18 Важно отметить, что большая часть этих данных может быть получена в «реальном времени», чтобы спортсмены выполняли запланированные задания.

Внутренняя тренировочная нагрузка — восприятие спортсменом усилий

Оценка воспринимаемой нагрузки во время сеанса (RPE) использовалась для количественной оценки внутренней тренировочной нагрузки спортсменов. По завершении каждой тренировки спортсмены выставляют оценку интенсивности тренировки от 1 до 10. Интенсивность тренировки умножается на продолжительность тренировки, чтобы обеспечить тренировочную нагрузку. Единицы измерения — «единицы RPE × минуты» и в футбольных кодексах обычно находятся в диапазоне от 300 до 500 единиц для тренировок с низкой интенсивностью и от 700 до 1000 единиц для тренировок с высокой интенсивностью.Для простоты в предыдущей работе мы называли их «произвольными единицами». Более точный термин может быть «минуты нагрузки». Ценность session-RPE будет зависеть от цели тех, кто его измеряет, и эта тема выходит за рамки данной статьи.

Мониторинг индивидуального благополучия спортсмена

Мониторинг благополучия спортсмена — обычная практика в спорте высших достижений.19–21 Используется широкий спектр субъективных вопросников, многие из которых используют простую 5, 7 или 10-балльную шкалу Лайкерта .19–23 Используются также более длительные и трудоемкие опросы24, 25

Эти анкеты используются для определения готовности спортсменов командных видов спорта к тренировкам. Обычно игроки сообщают о своем настроении, уровне стресса, энергии, сне и диете, а также о чувстве боли в верхней части тела, четырехглавой мышце, подколенном сухожилии, паху и икре. Сумма вопросов свидетельствует о самочувствии спортсмена. Затем практикующие специалисты могут адаптировать тренировочные предписания для игроков на индивидуальной основе (например, продолжить регулярные тренировки, исследовать тренировочные нагрузки или изменить тренировочную программу).

Взаимосвязь между тренировочной нагрузкой и травмой

Мониторинг тренировочной нагрузки становится все более популярным в спорте высших достижений, чтобы гарантировать, что спортсмены получают адекватный тренировочный стимул и минимизируют негативные последствия тренировки (риск травм, перетренированность). В следующем разделе я обсуждаю взаимосвязь между тренировочными нагрузками (как внутренними, так и внешними) и травмами у спортсменов командных видов спорта.

Внешние нагрузки и травмы

В элитной лиге регби игроки, которые выполняли большие объемы (> 9 м) бега на очень высокой скорости (> 7 м / с) за тренировку, составляли 2 балла.Вероятность получения бесконтактной травмы мягких тканей в 7 раз выше, чем у игроков, которые выполняли меньше бега на очень высокой скорости за тренировку (таблица 1) 26. Этот « порог » 9 м бега на очень высокой скорости ниже, чем обычно выполняются во время тренировок по другим командным видам спорта (например, по футболу и австралийскому футболу) 27 и, вероятно, отражает более высокие требования к контакту и повторяющимся усилиям, а также более низкие требования к бегу в лиге регби27. Например, в исследованиях австралийских футболистов , выше общая дистанция за 3 недели (73 721–86 662 м, OR = 5.5) и трехнедельная дистанция спринта (> 1453 м, OR = 3,7) были связаны с более высоким риском травм.13

Связь между внешними нагрузками и риском травм у игроков элитной лиги регби

Хотя внешние нагрузки Обычно при измерении с помощью устройств GPS, некоторые командные виды спорта подвергают спортсменов физически требовательным внешним нагрузкам, которые требуют очень небольшого бега на высокой скорости (например, бейсбольная подача, быстрый боулинг в крикете). Из исследований, проведенных в бейсболе, 28–30 более частых подсчетов подач были связаны с более высоким уровнем травм.Молодежные питчеры, которые сделали более 100 подач за сезон, имели в 3,5 раза больший риск травм, чем игроки, разбившие менее 100 подач.30

Подобные результаты наблюдались у игроков в крикет; Быстрые боулеры, которые подавали более 50 ударов в матче, подвергались повышенному риску травмы в течение 28 дней (OR = 1,62) .31 Кроме того, боулеры, которые подавали больше ударов за неделю (> 188 постановок, относительный риск = 1,4) и имели меньшее восстановление между сеансами (<2 дней, относительный риск = 2,4), подвергались большему риску травм, чем те, кто делал от 123 до 188 родов в неделю и имел 3–3 родов.99 дней восстановления между сеансами. Проблема усложняется тем, что боулеры, у которых еженедельно было меньше родов (<123 родов, относительный риск = 1,4) и выздоравливали быстрее (> 5 дней, относительный риск = 1,8), также подвергались повышенному риску травм.32

Внутренние нагрузки и травма

Эти данные о внешних нагрузках согласуются с результатами исследований внутренних нагрузок; более высокие тренировочные нагрузки были связаны с более высоким уровнем травматизма.11, 15, 33–36 В начале работы11 сильная взаимосвязь (r = 0.86) сообщалось между тренировочными нагрузками (полученными из сеансового RPE) и уровнем тренировочного травматизма в течение игрового сезона у полупрофессиональных игроков лиги регби (рисунок 2). Кроме того, за 3-летний период снижение тренировочных нагрузок заметно снизило уровень травматизма в той же группе игроков (рис. 3) .37 Вероятно, что чрезмерные тренировочные нагрузки, выполняемые на ранних этапах исследования, привели к перетренированности, что привело к всплеску тренировок. уровень травматизма. Однако следует отметить, что это исследование было опубликовано более 10 лет назад, и ни одно последующее исследование не повторило эти результаты.

Взаимосвязь между тренировочной нагрузкой и уровнем травматизма у спортсменов командных видов спорта. Тренировочные нагрузки измерялись с использованием оценки воспринимаемого метода нагрузки за сеанс. Перерисовано из Gabbett.11

Влияние снижения предсезонных тренировочных нагрузок на уровень травм и изменения аэробной подготовленности у спортсменов командных видов спорта. Тренировочные нагрузки измерялись с использованием оценки воспринимаемого метода нагрузки за сеанс. Повторно из Габбетта.37

У профессиональных игроков союза регби более высокие 1-недельные (> 1245 условных единиц) и 4-недельные совокупные нагрузки (> 8651 условных единиц) были связаны с более высоким риском травм.14 У игроков профессиональной лиги регби тренировочная нагрузка была связана с общей травмой (r = 0,82), неконтактной травмой поля (r = 0,82) и травмой контактного поля (r = 0,80). Полевая тренировочная нагрузка и общая травма поля (r = 0,68), неконтактная травма поля (r = 0,65) и травма контактного поля (r = 0,63). Силовые и силовые тренировочные нагрузки достоверно связаны с частотой возникновения силовых и силовых травм (r = 0,63). Значимой связи между тренировочными нагрузками в полевых условиях и частотой силовых и силовых травм не выявлено.Однако силовые и силовые тренировочные нагрузки были достоверно связаны с частотой контактных (r = 0,75) и неконтактных (r = 0,87) травм во время полевых тренировок. В совокупности эти результаты показывают, что (1) чем тяжелее тренируются игроки лиги регби, тем больше травм они получат и (2) высокие силовые и силовые нагрузки могут косвенно способствовать травмам на поле. Контроль тренировочных нагрузок и тщательное планирование тренировок на поле и в спортзале во избежание остаточной усталости необходимы для минимизации воздействия травм, связанных с тренировками, на профессиональных игроков лиги регби.

Различия в тренировочной адаптации между молодыми и старшими спортсменами

Возраст спортсмена влияет на адаптацию к тренировкам.38, 39 Габбетт38 исследовал тренировочные нагрузки, уровень травм и изменения физической работоспособности, связанные с 14-недельной программой тренировок на поле у ​​юниоров (приблизительно 17 лет) и старшие (примерно 25 лет) игроки лиги регби. Тренировки улучшили мышечную силу и максимальную аэробную мощность у юниоров и старших игроков, однако улучшение мышечной силы и максимальной аэробной силы было наибольшим у юниоров.Тренировочные нагрузки и травматизм были выше у старших игроков. Таким образом, игроки младшей и старшей лиги регби могут по-разному адаптироваться к определенному тренировочному стимулу, что предполагает изменение тренировочных программ с учетом различий в тренировочном возрасте.

Rogalski и др. 39 также показали, что при данной тренировочной нагрузке более старшие и более опытные (более 7 лет опыта участия в соревнованиях Австралийской футбольной лиги) были подвержены большему риску травм, чем менее опытные, более молодые (1–3 многолетний опыт участия в соревнованиях Австралийской футбольной лиги) игроков.Вероятно, что более высокий риск травм на тренировках у более опытных игроков усугубляется предыдущей травмой, которая является основным фактором риска новой травмы.40 Старые игроки, вероятно, испытали большее количество травм в течение своей карьеры, чем менее ранние. опытные игроки с первого по третий год. Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования зависимости доза-реакция между тренировкой и травмой у спортсменов разного возраста и пола.41

Моделирование взаимосвязи тренировочной нагрузки и травмы и ее использование для прогнозирования травм

В этом разделе основное внимание уделяется использованию тренировок мониторинг для моделирования взаимосвязи между нагрузкой и риском травм.

В течение двухлетнего периода Gabbett42 использовал сессионный RPE для моделирования взаимосвязи между тренировочными нагрузками и вероятностью травм у элитных игроков лиги регби. Тренировочная нагрузка и данные о травмах были смоделированы с использованием модели логистической регрессии с биномиальным распределением (травма против отсутствия травмы) и функцией логит-связи, при этом данные были разделены на предсезонную, раннюю и позднюю фазы соревнований.

Вероятность получения предсезонной травмы у игроков составляла 50–80% в диапазоне еженедельной тренировочной нагрузки от 3000 до 5000 произвольных минут (RPE × минуты, как указано выше).Эти «пороговые значения» тренировочной нагрузки для травм были значительно ниже (1700–3000 единиц тренировки в неделю) в соревновательной фазе сезона. Важно отметить, что на крутом участке сигмоидальной кривой тренировочной нагрузки-травмы очень небольшие изменения тренировочной нагрузки приводили к очень большим изменениям риска травм (рис. 4).

Взаимосвязь между тренировочной нагрузкой, тренировочной фазой и вероятностью травмы у элитных спортсменов командных видов спорта. Тренировочные нагрузки измерялись с использованием оценки воспринимаемого метода нагрузки за сеанс.Вероятность получения предсезонной травмы у игроков составляла 50–80% в диапазоне тренировочной нагрузки 3000–5000 условных единиц. Эти «пороги» тренировочной нагрузки были значительно снижены (1700–3000 условных единиц) в соревновательной фазе сезона (указано стрелкой и сдвигом кривой влево). На крутом участке предсезонной тренировочной кривой нагрузка-травма (обозначена серой заштрихованной областью) очень небольшие изменения тренировочной нагрузки приводят к очень большим изменениям риска травм. Предсезонная модель: вероятность травмы = 0.7 / (1 + exp (- (Тренировочная нагрузка − 2814,85) / 609,951)). Модель раннего соревнования: вероятность травмы = 0,713272 × (1-exp (-0,00038318 × тренировочная нагрузка)). Модель поздних соревнований: Вероятность травмы = 0,943609 / (1 + exp (- (Тренировочная нагрузка − 1647,36) / 485,813)). Повторно из Габбетта.42

Данные о тренировочной нагрузке и травмах предполагалось регистрировать в течение следующих двух соревновательных сезонов у этих элитных игроков лиги регби. Модель прогнозирования травм, основанная на запланированных и фактических тренировочных нагрузках, была разработана и реализована для определения возможности прогнозирования бесконтактных травм мягких тканей.За эти два сезона было получено сто пятьдесят девять бесконтактных травм мягких тканей. Процент истинно-положительных прогнозов составил 62% (N = 121), а ложноположительных и ложноотрицательных прогнозов — 13% (N = 20) и 11% (N = 18), соответственно. Игроки, которые превысили порог еженедельной тренировочной нагрузки, имели в 70 раз больше шансов получить положительный результат теста на бесконтактную травму мягких тканей, в то время как игроки, которые не превышали порог тренировочной нагрузки, получали травмы в 1/10 раза (таблица 2). Кроме того, после внедрения этой модели частота бесконтактных повреждений мягких тканей сократилась вдвое.42

Точность модели для прогнозирования бесконтактных повреждений мягких тканей

Мы также проанализировали распространенность травм и прогностические коэффициенты, полученные на основе модели. Распространенность травм в этой выборке профессиональных игроков лиги регби составила 8,6%. Если уравнение прогноза было положительным для данного игрока, вероятность травмы увеличивалась с 8,6% до 86%, а если результаты теста были отрицательными, вероятность травмы снижалась с 8,6% до 0,1%. При этом 87% (121 из 139 травм) из 8.6% игроков, получивших травму, были правильно идентифицированы моделью прогнозирования травм.

Хотя несколько коммерчески доступных программ утверждают, что они предсказывают травмы, связанные с тренировочной нагрузкой, на сегодняшний день это единственное исследование, позволяющее спрогнозировать травму на основе данных тренировочной нагрузки, применить эту модель в высокопроизводительной спортивной среде, а затем сообщить результаты в рецензируемый журнал. Мы признаем, что любая регрессионная модель, предсказывающая травмы, лучше всего подходит для населения, из которого она получена.Следует проявлять осторожность при экстраполяции этих результатов на другие виды спорта и другие группы населения. Несмотря на это потенциальное ограничение, эти результаты предоставляют информацию о тренировочной зависимости доза-реакция у элитных игроков лиги регби, а также научный метод мониторинга и регулирования тренировочной нагрузки у этих спортсменов. Важно отметить, что в командной среде такой подход позволяет управлять игроками на индивидуальной основе.

Критический элемент еженедельного изменения (обычно увеличивается!) Тренировочной нагрузки

Признавая, что высокие абсолютные тренировочные нагрузки связаны с повышенным риском травм, 42 специалисты по силовой и кондиционной подготовке должны также учитывать, как еженедельные изменения в тренировочной нагрузке независимо влияют на риск травм (помимо общей тренировочной нагрузки).В исследовании австралийских футболистов Piggott et al 34 показали, что 40% травм были связаны с быстрым изменением (> 10%) еженедельной тренировочной нагрузки на предыдущей неделе. Rogalski et al. 39 также показали, что более значительные изменения внутренней нагрузки за 1 неделю (> 1750 условных единиц, OR = 2,44–3,38), за 2 недели (> 4000 условных единиц, OR = 4,74) и предыдущую и текущую неделю (> 1250 условных единиц, OR = 2,58) были связаны с повышенным риском травм. Значительные еженедельные изменения тренировочной нагрузки (1069 условных единиц) также увеличивали риск травм у профессиональных игроков союза регби.14 Мы также смоделировали взаимосвязь между изменениями еженедельной тренировочной нагрузки (выраженной в процентах от тренировочной нагрузки предыдущих недель) и вероятностью травмы (неопубликованные наблюдения). Когда тренировочная нагрузка была довольно постоянной (от 5% меньше до 10% больше, чем на предыдущей неделе), у игроков был риск травмы <10% (рисунок 5). Однако, когда тренировочная нагрузка была увеличена на ≥15% по сравнению с нагрузкой на предыдущей неделе, риск травм увеличился до 21–49%. Чтобы свести к минимуму риск травм, практикующие должны ограничивать еженедельное увеличение тренировочной нагрузки до <10%.

Вероятность получения травмы при различных изменениях тренировочной нагрузки. Неопубликованные данные, полученные от профессиональных игроков лиги регби за три предсезонных подготовительных периода. Тренировочные нагрузки измерялись с использованием оценки воспринимаемого метода нагрузки за сеанс. Тренировочные нагрузки постепенно увеличивались на общей подготовительной фазе предсезона (т. Е. С ноября по январь), а затем снижались на специальной подготовительной фазе предсезонки (т. Е. В феврале). Программа тренировок перешла от упражнений с большим объемом и меньшей интенсивностью на общей подготовительной фазе к упражнениям с меньшим объемом и большей интенсивностью на конкретной подготовительной фазе.Каждый игрок участвовал в пяти организованных полевых тренировках и четырех силовых и силовых тренировках в тренажерном зале в неделю. За три предсезонки было получено 148 травм. Данные представлены как вероятности ± 95% доверительных интервалов.

Рассмотрение как острой, так и хронической тренировочной нагрузки: лучший способ смоделировать взаимосвязь между тренировкой и травмой?

Есть ли польза в моделировании взаимосвязи между тренировкой и травмой с использованием комбинации как острой, так и хронической тренировочной нагрузки? Острые тренировочные нагрузки могут составлять всего одно занятие, но в командных видах спорта 1 неделя тренировок представляется логичной и удобной единицей.Хронические тренировочные нагрузки представляют собой скользящее среднее за последние 3–6 недель тренировок. В этом отношении хронические тренировочные нагрузки аналогичны состоянию «фитнеса», а острые тренировочные нагрузки аналогичны состоянию «усталости» 2

Сравнение острой тренировочной нагрузки с хронической тренировочной нагрузкой в ​​виде отношения дает индекс подготовленность спортсмена. Если острая тренировочная нагрузка низкая (т. Е. Спортсмен испытывает минимальную «утомляемость»), а скользящая средняя хроническая тренировочная нагрузка высока (т. Е. Спортсмен развил «физическую форму»), то спортсмен будет в хорошо подготовленном состоянии. штат.Соотношение острой и хронической нагрузки будет около 1 или меньше. И наоборот, если острая нагрузка высока (т. Е. Тренировочные нагрузки быстро увеличиваются, что приводит к «утомляемости»), а скользящая средняя хроническая тренировочная нагрузка низкая (т. Е. Спортсмен не выполнял адекватные тренировки для развития «физической формы»), тогда спортсмен будет в утомленном состоянии. В этом случае соотношение острой: хронической нагрузки будет больше 1. Использование соотношения острой: хронической нагрузки подчеркивает как положительные, так и отрицательные последствия тренировки.Что еще более важно, это соотношение учитывает тренировочную нагрузку, которую выполнил спортсмен, по отношению к тренировочной нагрузке, к которой он или она был подготовлен.43

Было проведено первое исследование по изучению взаимосвязи между соотношением острой и хронической нагрузки и риском травм. на элитных быстрых боулерах по крикету.43 Тренировочные нагрузки оценивались как по сессионным RPE, так и по мячам. Когда острая рабочая нагрузка была такой же или ниже, чем хроническая рабочая нагрузка (т. Е. Соотношение острой: хронической нагрузки ≤0.99) вероятность травм для быстрых боулеров в следующие 7 дней составляла примерно 4%. Однако при соотношении острой и хронической нагрузки ≥1,5 (т. Е. Рабочая нагрузка на текущей неделе была в 1,5 раза больше, чем та, к которой был подготовлен боулер), риск травмы был в 2–4 раза выше в последующие 7 дней. 43

Используя общее недельное расстояние в качестве прогнозирующей переменной, почти идентичные результаты были получены у игроков элитной лиги регби44 и футболиста45; «Всплески» острой нагрузки по сравнению с хронической (т. Е. Когда соотношение острой и хронической нагрузки превышает 1.5) были связаны с повышенным риском травм.

По трем различным видам спорта (крикет, австралийский футбол и лига регби) руководство по интерпретации и применению данных о соотношении острой и хронической нагрузки показано на рисунке 6.46. –1,3 можно рассматривать как «золотую середину» тренировок, в то время как соотношение острой и хронической нагрузки ≥1,5 представляет собой «зону опасности». Чтобы свести к минимуму риск травм, практикующие врачи должны стремиться поддерживать соотношение острой и хронической нагрузки в пределах примерно 0.8–1.3. Возможно, что разные виды спорта будут иметь разную взаимосвязь между тренировочной нагрузкой и травмой; пока не будет получено больше данных, применять эти рекомендации к отдельным спортсменам следует с осторожностью.

Руководство по интерпретации и применению данных о соотношении острой и хронической нагрузки. Зона, заштрихованная зеленым цветом («зона наилучшего восприятия»), представляет собой соотношение между острой и хронической нагрузкой, при котором риск травм низок. Зона, заштрихованная красным («опасная зона»), представляет соотношение острой и хронической нагрузки, при котором риск травм высок.Чтобы свести к минимуму риск травм, практикующие врачи должны стремиться поддерживать соотношение острой и хронической нагрузки в пределах примерно 0,8–1,3. Повторно по Бланшу и Габбетту.46

Баланс между предотвращением травм и высокой производительностью: тренируется слишком много или недостаточно тренируется

Успешные спортивные команды сообщают о более низком уровне травм и большей доступности игроков, чем проигравшие команды47–49. Тренировочные нагрузки с высоким уровнем травматизма являются убедительными, поскольку упор на отрицательные аспекты тренировки отвлекает от многих положительных адаптаций, возникающих в процессе тренировок.Кроме того, есть несколько причин, по которым результаты, связывающие высокие тренировочные нагрузки с травмами, следует рассматривать в контексте широкого спектра проблем, связанных с производительностью, относящихся к спорту. Обертывание игроков ватой не принесет успеха на поле. Как практикующие специалисты могут помочь тренерам тренировать игроков на идеальном уровне (максимизировать производительность при сохранении низкого риска бесконтактных травм мягких тканей)?

Означает ли это, что спортсмены должны прекратить тренировки ?!

Хотя исследования показали положительную взаимосвязь между тренировочной нагрузкой и травмой, есть также доказательства, демонстрирующие, что тренировка имеет защитный эффект от травм.Результаты этих исследований следует учитывать при оценке влияния высоких тренировочных нагрузок на риск травм:

1. Спортсмены, занимающиеся командными видами спорта, которые тренировались более 18 недель до получения первоначальной травмы, подвергались пониженному риску получения последующей травмы.50 Эти результаты согласуются с другими выводами43, 44, которые показали, что высокие хронические нагрузки могут снизить риск травмы. Кроме того, более интенсивные тренировки перед поступлением в элитную футбольную программу среди юниоров были связаны со снижением риска развития боли в паху.51

2. Во-вторых, в широком диапазоне видов спорта хорошо развитые физические качества связаны со снижением риска травм. 50, 52–54 Очевидно, что у спортсменов развиваются физические способности, необходимые для обеспечения защитного эффекта от травм. , они должны быть готовы упорно тренироваться.

3. Важно отметить, что есть свидетельства того, что перетренированность и недотренированность могут увеличить риск травм.14, 28, 32 Например, быстрые боулеры в крикет, которые подавали меньше ударов в неделю с большим восстановлением между сессиями, имели повышенный риск. риск травмы, в то время как боулеры, которые подавали больше ударов в неделю с меньшим восстановлением между сессиями, также подвергались повышенному риску травм.Аналогичные результаты были получены в профсоюзах бейсбола и регби.14, 28 U-образная взаимосвязь между рабочей нагрузкой и травмами на основе этих данных демонстрирует, что как неадекватная, так и чрезмерная нагрузка связаны с травмами.

В совокупности эти результаты подчеркивают, что сокращение рабочих нагрузок не всегда может быть лучшим способом защиты от травм. Как практикующие находят «золотую середину» тренировочной нагрузки?

Тренировка умнее и усерднее — механизмы, которые могут лежать в основе этих выводов

Хотя высокие тренировочные нагрузки связаны с более высоким уровнем травм, результаты неоднозначны с недавними данными, которые также демонстрируют защитный эффект высоких хронических тренировочных нагрузок.43, 44 В этом разделе я подробно остановлюсь на данных, приведенных в таблицах 1 и 2. Таблица 1 выше показывает, что игроки, выполнявшие большее количество бега на очень высокой скорости, имели в 2,7 раза больше шансов получить бесконтактное повреждение мягких тканей, чем игроки с более низкими беговыми нагрузками26. Учитывая высокий риск травм при больших беговых нагрузках, возникает соблазн предложить спортсменам избегать бега на очень высоких скоростях во время тренировок, чтобы минимизировать риск травм. Однако, ограничивая беговые нагрузки в попытке снизить риск травмы, возможно, что во время критических переходов игры, когда от игроков требуется максимальная нагрузка, они непреднамеренно подвергаются большему риску травмы из-за недостаточной подготовки.

Большее количество бега на очень высокой скорости может быть связано с повышенным риском травм, однако есть свидетельства (из того же набора данных) более низкого риска травм, когда игроки выполняли большее количество упражнений с низкой интенсивностью и короткие усилия по ускорению.26 Высокий -интенсивные командные виды спорта, такие как футбол, баскетбол и регби, требуют от игроков выполнения коротких (2–3 с) ускорения, 55 с последующими более длительными упражнениями с меньшей интенсивностью.56 На соревнованиях более длительные усилия на высокой скорости не распространены.57

Учитывая, что высокие тренировочные нагрузки могут быть достигнуты разными способами (т. Е. Объем, интенсивность и частота тренировок, а также баланс выполняемых тренировок), неуместно рассматривать все «высокие тренировочные нагрузки» как несущие идентичные травмы. риск. Чтобы быть точным, «высокие тренировочные нагрузки» сами по себе могут не быть самым большим фактором, способствующим повышенному риску травм, скорее, тип «высоких тренировочных нагрузок», который предписывается, может быть важным предиктором травм. Увеличение количества коротких, высокоинтенсивных тренировок с ускорением и аэробной активности для конкретных игр может дать спортсменам командных видов спорта соответствующие физические качества, чтобы не только выступать на высоком уровне, но и защищать от травм.

Таблица 2 иллюстрирует точность модели прогнозирования травм. Это демонстрирует, что модель тренировочной нагрузки была как чувствительной, так и специфичной для прогнозирования бесконтактных повреждений мягких тканей. Тем не менее, модель прогнозирования травм намного лучше позволяла определять, когда вероятность травм маловероятна (т. Е. Истинно отрицательные), чем прогнозировать травмы. Эти выводы интуитивно понятны; если работоспособный персонал сосредоточен на предотвращении травм и предотвращении травм посредством « управления спортсменами, не участвующими в тренировках », тогда можно ожидать небольшое количество травм, связанных с тренировочной нагрузкой, поскольку спортсмены вряд ли когда-либо будут тренироваться с адекватными объемами или интенсивностью, чтобы получить травму .

Также обратите внимание, что на рисунке 4 на крутом участке кривой тренировочная нагрузка – травма небольшие изменения тренировочной нагрузки (увеличиваются или уменьшаются) приводят к большим изменениям риска травм (в соответствующем направлении). В этом исследовании недооценивается тот факт, что из-за сигмоидального характера кривой при больших тренировочных нагрузках взаимосвязь тренировочная нагрузка-травма почти полностью «плоская». На этом участке кривой большие изменения тренировочной нагрузки приводят к очень небольшим изменениям риска травм.Таким образом, если спортсмены могут безопасно тренироваться на участках кривой «высокого риска» (с использованием модели соотношения острой и хронической нагрузки), то они могут развить большую устойчивость и толерантность к тренировкам.

Хотя модели прогнозирования травм могут иметь достаточную точность прогнозов, чтобы гарантировать систематическое использование в программе элитных командных видов спорта, существует прекрасный баланс между тренировкой, снижением тренированности и перетренированностью. Программы тренировок должны быть физиологически и психологически подходящими58, чтобы игроки могли справляться с требованиями соревнований.Имея это в виду, можно утверждать, что целесообразно использовать предсезонную подготовку и тренировочные сборы для назначения высоких тренировочных нагрузок (примечание, не чрезмерных), чтобы определить, какие игроки наиболее подвержены травмам в физически стрессовых ситуациях (эти игроки, скорее всего, не будут переносят интенсивность и усталость соревнований), и какие игроки не восприимчивы к травмам в физически стрессовых ситуациях (эти игроки более склонны переносить интенсивность и усталость соревнований).

Новый взгляд на обучение — «вакцина» от травм!

В данной статье предлагается парадокс предотвращения травм и тренировок. Физически тяжелые (и соответствующие) тренировки могут защитить от травм. Нет никаких сомнений в том, что высокие тренировочные нагрузки обычно связаны с более развитой физической подготовкой и, следовательно, с хорошей производительностью. Одной из издержек высокой тренировочной нагрузки часто считается риск повреждения мягких тканей. Чтобы снизить этот риск, тренировочные нагрузки могут быть уменьшены, чтобы снизить частоту травм, однако низкие тренировочные нагрузки (в виде уменьшенных тренировочных объемов) также были связаны с повышенным риском травм; воздействие на игроков низких тренировочных нагрузок может подвергнуть их риску получения дальнейших травм.Когда игроки вступают в процесс реабилитации, перед практикующими специалистами стоит задача подвергнуть их подходящим нагрузкам для улучшения физических качеств, которые обеспечивают защитный эффект от травм и предотвращают «всплески» нагрузок, когда игроки возвращаются к полноценной тренировке. В результате команды нередко имеют в своей команде постоянного «реабилитолога» — игрока, который неоднократно выходит из строя (возможно, с различными травмами), потому что его или ее тренировочная нагрузка недостаточно высока для адаптации к требованиям матча. .Представленные данные показывают, что назначение высоких тренировочных нагрузок может привести к повышению уровня физической подготовки, что, в свою очередь, обеспечивает защитный эффект от травм, что в конечном итоге приводит к (1) большей физической мощности и устойчивости на соревнованиях и (2) большей доле тренировок. состав доступен для выбора каждую неделю (рисунок 7).

Взаимосвязь между физическими качествами, тренировочной нагрузкой и риском травм у спортсменов командных видов спорта.

Выводы

В заключение, хотя существует взаимосвязь между высокими тренировочными нагрузками и травмами, эта статья демонстрирует, что проблема не в тренировке как таковой , , а, скорее, в несоответствующей тренировке, которая предписывается.Чрезмерное и быстрое увеличение тренировочных нагрузок, вероятно, является причиной значительной части бесконтактных травм мягких тканей. Однако физически тяжелые (и соответствующие) тренировки развивают физические качества, которые, в свою очередь, защищают от травм. В этом документе подчеркивается важность мониторинга тренировочной нагрузки, включая нагрузку, к которой готовы спортсмены (путем расчета соотношения острой и хронической нагрузки), как передового практического подхода к долгосрочному сокращению травм, связанных с тренировками.

Какие выводы?

• Существует догма о влиянии высоких (и низких) тренировочных нагрузок на травмы.

• В этом обзоре подчеркивается положительное и отрицательное влияние высоких тренировочных нагрузок на риск травм, физическую форму и, следовательно, на производительность.

• Между высокими тренировочными нагрузками и травмами существует взаимосвязь, но хорошо развитые физические качества защищают от травм.

• Соотношение острой и хронической тренировочной нагрузки является лучшим предиктором травмы, чем отдельные острые или хронические нагрузки.

Как это может повлиять на клиническую практику в будущем?

• Во многих условиях высокой производительности тренировочные нагрузки сообщаются еженедельно. Регистрация острых и хронических тренировочных нагрузок и моделирование соотношения острой и хронической нагрузок позволяет практикующим специалистам определять, находятся ли спортсмены в состоянии «физической формы» (т. Е. Чистое восстановление после тренировки, риск травм ниже среднего) или «усталость» (т. Е. чистая тренировочная нагрузка, риск травмы выше среднего).

• Модель парадокса предотвращения травм и тренировок позволяет практикующим специалистам контролировать и назначать тренировки спортсменам в командных видах спорта на индивидуальной основе.

• Доказательства влияния острой и хронической тренировочной нагрузки на риск травм, физическую форму и работоспособность позволят практикующим систематически назначать высокие тренировочные нагрузки, сводя к минимуму риск получения спортсменами травм, связанных с нагрузкой.

Термочувствительный альтернативный способ сплайсинга воспринимает и опосредует температурную адаптацию у Drosophila

Существенные изменения:

Основные научные проблемы, которые необходимо решить, относятся к: (a) необходимости более четко установить функцию изоформы tim-sc.И (б) более глубокое рассмотрение механизма, с помощью которого происходит сращивание по времени. Кроме того, рукопись может быть сжата, и ее необходимо отредактировать, чтобы улучшить читаемость, а иногда и грамматику.

1) Чтобы проверить, являются ли изоформы tim функциональными, их следует поместить на фон tim ⁰ , чтобы проверить, сохраняют ли они ритмичность при различных температурах. Это очень важно для истории. Группа Сегала показала, что тим-М частично спасает мутанта, а тим-холод также спасает.Было бы интересно посмотреть, что делает tim-sc на фоне ⁰ в LD и DD. Непонятно, почему этого не было сделано.

Благодарим рецензентов за это предложение. Чтобы решить эту проблему, мы определили, может ли TIM-SC спасти поведенческие ритмы у мух tim ⁰¹ . Мы обнаружили, что экспрессия UAS- tim-sc с использованием драйвера Tim- Gal4 спасает фенотип tim ⁰¹ при LD (Фигуры 6A, C).Кроме того, мы наблюдаем частичное спасение (~ 40% мух) в DD. Интересно, что мы обнаружили, что у мух, у которых восстанавливаются двигательные ритмы, период короче 24 часов (23 часа, рис. 6B-C). Эти результаты демонстрируют, что, несмотря на значительно меньший размер, TIM-SC является функциональным.

Кроме того, как было предложено рецензентами, мы переэкспрессировали tim-sc и tim-L в на ⁰¹ мух. Мы наблюдали вечерний компонент у небольшого процента мух (18%), предполагая, что TIM-SC может действовать независимо от PER.В любом случае в DD мухи остаются аритмичными (рисунок 6 — приложение к рисунку 2).

2) Модель, согласно которой температурная специфичность временного сплайсинга возникает из интрона, служащего термодатчиком, является особенно интересным аспектом статьи. Было бы информативно представить и обсудить предсказанные вторичные структуры РНК экзонных и интронных последовательностей, участвующих в различных временных событиях альтернативного сплайсинга. Каковы прогнозируемые изменения вторичной структуры, которые происходят при переходе от 18, 25 и 29 ° C.Кроме того, изменяются ли и какие особенности вторичной структуры в результате мутаций сигнала полиаденилирования и расщепления (используемых для отмены tim-sc на основе CRISPR) в интроне 10. Следует также предпринять попытку (например, с помощью конструкций экзон-интрон мини-гена в клетках S2 ), чтобы более точно проверить, обеспечивают ли сами тим-экзон-интроны температурно-зависимый паттерн сплайсинга.

Как и предполагалось, теперь мы использовали программное обеспечение для предсказания вторичной структуры термочувствительных интронов и их фланкирующих экзонов.Интересно, что мы обнаружили, что 5’-сайт сплайсинга в интронах, сплайсинг которых предотвращает образование tim-sc или tim-cold , сильно задействован во вторичных структурах. Мы постулируем, что при более низких температурах эти структуры более стабильны (как и любая вторичная структура РНК) и, следовательно, менее доступны для распознавания сплайсосомой. Это могло бы объяснить, почему эти интроны не распознаются как таковые при 18 ° C и остаются в мРНК. Интересно, что сигнал расщепления и полиаденилирования, необходимый для генерации изоформы tim-sc , не участвует во вторичной структуре.С другой стороны, предсказанные структуры РНК интрона, содержащегося в tim-M , предполагают, что ни 5 ’, ни 3’ сайт сплайсинга не задействованы во вторичной структуре. Поскольку эффективность сплайсинга обычно увеличивается при более низких температурах, неудивительно, что этот интрон будет больше пропускаться при 29 ° C, что приведет к увеличению количества РНК tim-M . Наконец, мы также показали, что предсказанная структура РНК интрона tim-sc и фланкирующих экзонов не изменяется при делеции последовательности сайта расщепления и полиаденилирования в интроне.Мы полагаем, что эти оценки вместе с экспериментами с минигенами убедительно доказывают возможность того, что сами интроны действуют как термометры. Мы благодарим рецензента за предложение решения этой проблемы и включили предсказанные структуры, а также это объяснение в новую версию рукописи (рисунок 8 — приложение к рисунку 2).

3) Учитывая альтернативно сплайсированные изоформные коды (tim-sc) для функционального белка (подраздел «Устранение tim-sc приводит к изменениям в процессинге tim и локомоторной активности», последний абзац), последствия для его белковых взаимодействий четко не выяснено.Насколько важны домены для взаимодействия с PER из-за альтернативного сплайсинга? Нормальны ли связывание и стабилизация PER и его миграция в ядро?

Мы благодарим рецензентов за то, что подняли этот вопрос. Известно, что две области в TIM имеют решающее значение для взаимодействия с PER: одна, которая включает сигнал ядерной локализации, а другая — между аминокислотой 715 и аминокислотой 914 канонического белка TIM (Saez and Young, 1996). Поскольку tim-sc кодирует усеченную версию белка TIM (892 а также), возможно, что способность TIM-SC связываться или взаимодействовать с PER нарушена.Поэтому мы проверили, может ли TIM-SC связывать и стабилизировать PER. Действительно, в экспериментах, проведенных на клетках S2, мы показали, что хотя TIM-L сильно стабилизирует PER (как сообщалось ранее), экспрессия TIM-SC не приводит к стабилизации PER. Кроме того, мы провели эксперименты по совместной иммунопреципитации и обнаружили, что как TIM-L, так и TIM-SC могут связываться с PER. Более того, связывание TIM-SC кажется сильным, поскольку оно может сохраняться в присутствии TIM-L. Эти результаты показывают, что TIM-SC действует по другому механизму, который включает связывание PER, но не стабилизацию PER.Мы добавили эти эксперименты в новую версию рукописи (рис. 6 и рис. 6 — приложение к рисунку 1). Мы благодарим рецензентов за то, что они подняли этот вопрос, поскольку это действительно улучшило рукопись.

Менее критические вопросы:

4) Общий статистический момент: авторы предпочитают использовать множественный t-критерий с поправкой Холма-Сидака. Для некоторых анализов лучше использовать ANOVA (одно- или двусторонний) с апостериорными тестами — гораздо более элегантно и информативно для основных эффектов и взаимодействий, особенно в двустороннем анализе, например.грамм. для данных на рис. 6D и E и, возможно, даже трехсторонний для 6F.

Благодарим рецензентов за это предложение. Следуя их совету, мы повторно проанализировали данные на рис. 3A, 4B, 6D, 6E, 6F, 7B и 7D, используя двусторонний дисперсионный анализ. Мы включили эти результаты в новую версию рукописи. Используя эти тесты, мы получили результаты, аналогичные тем, которые упомянуты в оригинальной рукописи.

5) Подраздел «Температура изменяет циркадный транскриптом», первый абзац.Для анализа авторы использовали цикл JTK. Каков был порог значимости и использовалась ли поправка на множественное тестирование? Я не могу найти этого в Материалах и методах.

Мы благодарим рецензента за указание на это. Мы действительно изначально заявили об этом в методах, но, возможно, рецензент это пропустил. Вкратце, ген считался циклическим, если p-значение JTK было меньше 0,05, а амплитуда больше 1,5. Кроме того, мы процитировали Hughes et al., 2010, в материалах и методах, где указано, что тест JTK выполняет настройку Бонферрони для корректировки для множественного тестирования.

6) Подраздел «Температура изменяет циркадный транскриптом», первый абзац. Рисунок 1A — не очевидно, что на холоде у этих панелей фаза цикла наступает раньше.

Рецензенты правы, разницы фаз цикла на этих графиках не видны. Мы пытаемся передать то, что есть ритмические записи при всех температурах. Однако, как вы можете видеть на диаграмме Венна на Рисунке 1B, не так много транскриптов, которые циклически изменяются при всех температурах, что делает этот прогресс в цикле невозможно увидеть, если вы не сосредоточитесь на определенных генах, как это сделано на Рисунке 1C.Теперь мы изменили это в рукописи.

7) Подраздел «Температура изменяет циркадный транскриптом», первый абзац. Рисунок 1C: более ранняя фаза тактовых генов — некоторые из этих тактовых генов не показывают значительных циклов — я быстро взглянул на необработанные данные в дополнительном файле 1, поэтому я не уверен, что на самом деле представляет эта цифра … Это нормально, если вы просто включите, per, tim и vri, которые надежно циклически меняются.

Мы понимаем точку зрения рецензентов. Первоначально мы включили в этот анализ Clk и cry , но они не так сильны, как per, tim или vri , что может вызвать путаницу.Теперь мы ограничили анализ сильными циклерами (как предлагается) и наблюдаем явное улучшение пика их экспрессии при 18 ° C по сравнению с 25 ° C (рис. 1C).

8) Подраздел «Холодная температура снижает уровни TIM-L двумя независимыми механизмами», первый абзац. Shakhmantsir et al., 2018, возможно, видели полосу на вестерне, соответствующую tim-M (см. Их рисунок 5B), поэтому она кодирует продукт TIM.

Мы благодарим рецензентов за то, что подняли этот вопрос. Действительно, Шахманцир и др., 2018 описывают полосу, которая соответствует TIM-M при сверхэкспрессии TIM ^TINY (обозначена как TIM-M в нашей рукописи), но не в контроле, что позволяет предположить, что эндогенный белок TIM-M отсутствует. В любом случае мы поддерживаем гипотезу, согласно которой этот транскрипт находится под сильной посттранскрипционной регуляцией (как показано на рисунке 4C), что может предотвратить его трансляцию в нормальных условиях (то есть без сверхэкспрессии, которая в конечном итоге может превысить порог, зависящий от miRNA. для перевода).Тем не менее, мы согласны с тем, что нефункциональность будет более точной, и теперь это исправлено в новой версии рукописи (подраздел «Холодная температура снижает уровни TIM-L двумя независимыми механизмами», первый абзац).

9) Рисунок 4C и подраздел «Холодная температура снижает уровни TIM-L двумя независимыми механизмами», третий абзац. Когда авторы заявляют, что уровни репортера LUC были высокими — по сравнению с чем? Это предполагает незначительное участие miRNA для tim-sc.Однако, поскольку эндогенные уровни tim-sc в голове мух низкие при 25 ° C (Figure 2C), означает ли это, что эти низкие уровни мало связаны с miRNAs, дестабилизирующими транскрипт?

Мы благодарим рецензентов за то, что подняли этот вопрос. На рисунке 4C мы сравниваем уровни люциферазы, полученные от мух, экспрессирующих разные репортеры между собой. Мы заметили, что репортеры, включая tim-M или tim-cold 3 ’UTR, значительно ниже, чем другие репортеры (те, которые включают tim-sc или tim-L 3’ UTR).Поскольку все репортеры экспрессируются на одном уровне (поскольку трансгены вставлены в одно и то же место генома), мы предполагаем, что различия связаны с посттранскрипционным контролем. Наша гипотеза заключается в том, что низкие уровни timsc при 25 ° C связаны с более низким удерживанием этого интрона при более высоких температурах, а не с повышенной дестабилизацией транскрипта с помощью miRNA или других посттранскрипционных механизмов. Мы переписали этот раздел, чтобы упростить и прояснить этот момент (подраздел «Холодная температура снижает уровни TIM-L двумя независимыми механизмами»), а также добавили параграф в Обсуждение по этой теме (седьмой параграф).

10) Подраздел «Сверхэкспрессия различных изоформ TIM по-разному изменяет циркадное поведение», первый абзац. Есть ли соответствующее продвижение в компоненте M в tim-sc — конечно, похоже, — может быть, также и в tim-cold?

Это хороший момент. Мы действительно измерили его количественно и, хотя тенденция схожа, мы не обнаружили статистически значимых различий в наступлении утреннего ожидания. Теперь мы добавили эти результаты на рисунок 5B и добавили предложение в первом абзаце подраздела «Сверхэкспрессия различных изоформ TIM по-разному изменяет циркадное поведение», чтобы описать это.

11) Подраздел «Устранение tim-sc приводит к изменениям в процессинге tim и двигательной активности», первый абзац. Некоторые описания актограмм немного субъективны. Я бы описал наиболее очевидное различие — это очень сильная сиеста у мутанта при 29 ° C. Об этом не упоминается. Также кажется, что есть уменьшение M ожидания включения света. Одна поразительная особенность рисунка 6C — отсутствие вариаций в профилях 40A, что затрудняет сравнение 40A с контролем, поскольку последние профили кажутся слишком неряшливыми.

Рецензенты правы. Мы повторили этот эксперимент несколько раз, но эта более низкая вариабельность мутантов 40А по сравнению с контролем была постоянной. Мы изменили текст, включив в него сильный фенотип полуденной сиесты, проявляемый мутантами при 29 ° C (подраздел «Удаление tim-sc приводит к изменениям в процессинге tim и локомоторной активности, первый абзац).

12) Авт. Заключают, что tim-M и tim-cold строго посттранскрипционно регулируются посредством miRNAs при всех температурах.Хотя это совпадает с уровнями экспрессии для tim-cold на фиг. 2C, неясно, что касается tim-M, который относительно высоко экспрессируется при всех температурах, часто выше, чем каноническая изоформа (18 <25 <29). Это нужно объяснить.

Мы благодарим рецензентов за указание на это. Действительно, исходя из уровней люциферазы у мух, сверхэкспрессирующих люциферазу , слитых с различными 3 ’UTRs tim , мы заключаем, что tim-M также находится под сильной посттранскрипционной регуляцией.Кроме того, в AGO1-IP с последующим секвенированием малых РНК мы обнаружили, что некоторые из miRNA, которые, как было предсказано, связываются с tim-M , изменяются в зависимости от температуры (некоторые из них активируются, а другие подавляются с повышением температуры). Это говорит нам о том, что tim-M находится под сильной посттранскрипционной регуляцией при всех температурах. Хотя, как отмечают обозреватели, экспрессия tim-M очень высока при большинстве температур, мы утверждаем, что эта сильная посттранскрипционная регуляция не противоречит уровням экспрессии, показанным на рисунке 2C, поскольку miRNA могут действовать, дестабилизируя мРНК и / или ингибируя трансляцию. .Мы признали это в Обсуждении (четвертый абзац).

[Примечание редакции: до принятия были запрошены дополнительные изменения, как описано ниже.]

Рецензенты отмечают, что работа по связыванию создания специфичной для 18C, вневременной изоформы сплайсинга Tim-Sc с температурной адаптацией циркадных часов был улучшен и усилен несколькими дополнительными экспериментами. Новый анализ взаимодействий Tim-Sc Per, а также фенотипических эффектов экспрессии tim-sc у на ⁰ мух согласуется с запускаемыми Tim-sc, независимыми от PER (но еще не определенными) механизмами температурной адаптации циркадных часов.

Однако рукопись требует обширных исправлений текста и некоторых простых экспериментальных дополнений, прежде чем ее можно будет считать приемлемой для публикации. Текст плотный, трудный для чтения, кажется, был скомпонован на скорую руку и требует значительной доработки, чтобы сделать его более удобным для чтения. Он также содержит несколько ошибок, включая неправильное описание tim-sc, которое является основным для этой рукописи, и отсутствующие ссылки. Кроме того, он включает утверждения, которые не подтверждаются данными.Несколько очень общих заявлений о временном сращивании обычных клеточных термометров выходят далеко за рамки результатов — когда существуют простые эксперименты, чтобы определить, может ли это быть правдой. Требуется несколько строк изменений. Во-первых, рукопись должна быть тщательно отредактирована для обеспечения ясности, грамматики и точности, чтобы она была легко доступной и всеобъемлющей для читателя. И, во-вторых, особенно с учетом того, что выводы, хотя и интересны, не являются решающими в отношении механизма, с помощью которого работает Tim-Sc, некоторые ключевые поведенческие эксперименты (комментарии 12, 13) также должны проводиться при более низких температурах (18 ° C), чтобы лучше результаты тестирования, которые предлагает моделирование РНК для стабильности изменений с температурой.

Благодарим рецензентов за полезные комментарии и предложения. Мы теперь включили поведенческие и дополнительные эксперименты с люциферазой при 18 ° C. Мы также тщательно отредактировали рукопись, чтобы прояснить несколько неоднозначных аспектов, и добавили недостающие ссылки. Благодарим рецензентов за помощь в улучшении рукописи.

Пожалуйста, найдите наш подробный ответ на комментарии рецензентов ниже.

Основные комментарии:

1) Первое предложение не имеет смысла — «деградация генов»? Может быть, «генные продукты часов»?

Мы благодарим рецензентов за то, что подняли этот вопрос.Это была наша ошибка. Мы изменили реферат в новой версии рукописи.

2) «мало что известно…» кажется немного резким? Другие, которые работают в этой области, такие как Ральф Станевски и Исаак Эдери, могут не согласиться с этим, и, возможно, их идеи следует признать.

Мы благодарим рецензентов за то, что подняли этот вопрос. Мы перефразировали эти утверждения в новой версии рукописи.

3) Введение, третий абзац. TIM — это не ключевой фактор, это ключевой фактор.

См. Ниже.

4) Введение, третий абзац. Tim является ключевым фактором для световой сигнализации «не». TIM — это ключевой путь для передачи внешней информации в циркадную систему на молекулярном уровне ». Авторы преувеличивают роль TIM во всех факторах окружающей среды, освещении, температуре, социальных сетях и т. Д. Это неверно.

Ответ на пункты 3 и 4: рецензенты правы, и мы благодарим их за то, что подняли этот вопрос. Мы перефразировали эти утверждения в новой версии рукописи.

5) Введение, четвертый абзац. Majercak et al., 2004, также следует цитировать вместе с Collins et al., 2004.

Мы добавили эту ссылку.

6) Введение, четвертый абзац. Группа Edery проделала много дополнительной работы по каждому стыку, что в некоторой степени прояснило, как каждое сращивание может повлиять на тепловую адаптацию. Здесь следует немного подробнее остановиться.

Рецензенты правы. Мы добавили несколько новых предложений во Введение.

7) Большинство цифр — авторы должны указать, что представляют собой полосы ошибок -SEMS?

Спасибо, полосы ошибок действительно соответствуют SEM. Сейчас мы исправили это во всех легендах к фигурам и дополнениях к фигурам.

8) Подраздел «Температура модулирует альтернативное сращивание времени», первый абзац — при низкой температуре сращивания наблюдается трехкратное увеличение, так что tim — не единственный тактовый ген со значительной термической структурой сплайсинга. Также Монтелли и др., 2015, показали, что при 10 ° C на одно сращивание отражается около 50% общего транскрипта и около 90% временного транскрипта при этой температуре, даже если общие уровни tim являются низкими. Удивительно, что это очень актуальное исследование даже не упоминается и не цитируется. Отметим, что он упоминается в третьем абзаце Обсуждения в другом контексте, но не упоминается в ссылках.

Мы благодарим рецензентов за этот момент. Мы описали шаблоны, которые мы нашли более подробно, чтобы решить эту проблему.Важно отметить, что изоформы, индуцированные холодом, составляют более 50% всех мРНК tim при 18 ° C и менее 10% при 25 ° C, в то время как изоформы, индуцированные холодом, на не более 30 % транскриптов при 18 ° C. Монтелли и др., 2015 были процитированы через пару предложений после того, как мы описали изоформу tim-cold и несколько раз по всей рукописи. Тем не менее, мы согласны с тем, что добавление предложения, поясняющего, что образцы температурной зависимости на сращивания могут быть усилены в другом температурном диапазоне, могло бы добавить к рукописи.Мы добавили это в новую версию рукописи.

9) ‘В отличие от других изоформ, которые генерируются удерживанием интрона, мРНК tim-sc генерируется за счет использования альтернативного сайта расщепления и полиаденилирования, расположенного в интроне 10 tim, который может использоваться только перед этим интроном расколот ».

См. Ниже.

10) Это предложение не имеет грамматического смысла и не имеет биологического смысла. Авторы предполагают, что интрон сплайсирован.Если да, то как можно использовать сайты STOP, расщепления и полиА? Неужели этот интрон или его часть тоже нужно сохранить?

Пункты 9 и 10: Мы благодарим рецензентов за то, что заметили эту ошибку. Действительно, tim-sc происходит из-за удерживания интрона 10. Тем не менее мы хотели подчеркнуть, что, в отличие от изоформ порядка, tim-sc имеет независимое расщепление и сайт полиА. Мы перефразировали предложение, чтобы было понятнее.

11) «Как упоминалось выше, эта изоформа появляется только при 18 ° C, что убедительно свидетельствует о том, что эта изоформа отвечает за адаптацию к холодным температурам».Это интуитивный скачок, основанный на корреляции — на данном этапе нельзя предполагать причинно-следственную связь. Если бы это было так, разве нельзя было ожидать более высоких уровней tim-sc и tim-cold у D. virilis при более низких температурах? Так почему же «удивительно», что D. virilis действительно показывает более высокие уровни холода при более низких температурах? Разве присутствие холода у всех видов на более высоких уровнях при более низких температурах не доказывает, что это сохраненный, важный транскрипт для холодная адаптация?

Мы благодарим рецензентов за этот комментарий.Мы согласны с тем, что корреляция не подразумевает причинно-следственной связи, и смягчили утверждение. Однако только внешний вид timsc коррелирует с различиями в соотношении день / ночь между 18 ° C и 25 ° C. Мы согласны с тем, что более широкая эволюционная консервация может предполагать, что tim-cold важен для общей адаптации циркадной системы к изменениям температуры. Однако мы утверждаем, что tim-sc может быть важным для мух, чтобы различать 18 ° C и 25 ° C, поскольку из штаммов, проанализированных в этом исследовании, только D.melanogaster и D. simulans (оба экспрессируют tim-sc ), по-видимому, обладают определенными зависимыми от температуры моделями активности между 18 ° C и 25 ° C. Хотя верно, что D. virilis также демонстрирует различия в активности между этими двумя температурами, картина обратная (более высокое соотношение активности день / ночь при 25 ° C вместо более низкого). Кроме того, tim-cold , по-видимому, сильно экспрессируется в этом штамме даже при высоких температурах (29 ° C).В любом случае мы поняли суть и изменили текст на «важно для» вместо «ответственный за», поскольку действительно корреляция не подразумевает причинно-следственную связь на данном этапе.

12) Рисунок 5 — Почему поведенческий анализ также не проводился при 18 ° C, учитывая, что все это делается на фоне WT? Это необходимо сделать и включить, а полученные результаты обсудить.

Мы понимаем поднятый рецензентами вопрос и выполнили эксперимент при 18 ° C, как было предложено. Однако мы хотели бы отметить, что основной целью этого эксперимента было определение функциональности белков (в частности, TIM-SC).В любом случае мы включили новый эксперимент в новую версию рукописи.

13) Рис. 6A – C. Опять же, может быть бесполезно исследовать спасение Tim ⁰¹ при более низкой температуре? Возможно, разные UTR более или менее стабильны при разных температурах? Это, кажется, стоит попробовать, учитывая последний раздел о структуре РНК?

Мы понимаем точку зрения, поднятую рецензентами, и выполнили эксперимент при 18 ºC, как было предложено. Однако мы хотели бы отметить, что все конструкции сверхэкспрессии tim содержат одни и те же 3 ’UTR (SV40, который не контролируется посттранскрипционно).

14) «Эти результаты демонстрируют, что, несмотря на меньший размер, tim-sc кодирует полностью функциональный белок TIM». Почему «полностью» с спасением всего 42%?

Мы основали нашу оценку на том факте, что канонический белок TIM-L спасает в аналогичной степени. Мы интерпретируем это частичное спасение с помощью системы GAL4, а не эндогенного промотора, для управления экспрессией TIM. В любом случае мы смягчили это утверждение и добавили в Обсуждение несколько предложений.

15) «Контрольные мухи показали два разных ответа при переводе на 18 ° C: задержка вечернего компонента, а также снижение ночной активности по сравнению с мухами, которых содержали при 25 ° C» (рис. 6C, 6D и 6E). ).«Имеют ли авторы в виду рис. 7C, D, E.

Мы благодарим рецензентов за то, что подняли этот вопрос. Мы исправили ошибку в новой версии рукописи.

16) «Кроме того, характер активности мух 40A поразительно похож при разных температурах». Не совсем, и не более того, чем элементы управления. Если изучить панели 7D и 7E, два фенотипа изменяются больше в 40A, чем в контроле.

Мы благодарим рецензента за то, что он поднял этот вопрос. Мы внесли соответствующие поправки.Как мы объясняем в тексте, мы интерпретируем все еще высокую дневную / ночную активность при 18 ° C как перенаправление транскрипции в сторону варианта сплайсинга tim-cold (рис. 7F).

17) «И последнее, но не менее важное: наши данные показывают, что альтернативное сращивание может действовать как термометр для ячейки». Это очень общее утверждение, не ограничивающееся даже циркадными часами. Если это так, то мутанты с временным сплайсингом также должны влиять на другие температурно-зависимые фенотипы.Почему бы авторам не проверить один из них, например температуру, при которой чувствительные к температуре мутанты становятся парализованными, например. говно, параты и тд? Достаточно просто сделать, но вряд ли поддержит общее утверждение авторов.

Мы понимаем точку зрения рецензентов. Мы изменили утверждение, чтобы сделать его специфичным для циркадных часов.

Ячейки | Бесплатный полнотекстовый | Мертк взаимодействует с Tim-4 для усиления опосредованного Tim-4 эффероцитоза

Вклад авторов

Концептуализация, Б.М. и Д.П .; методология, B.M., Y.-E.J. и D.P .; валидация, B.M., J.Y., S.-A.L., C.M., H.M. (Хёнджи Мун), D.K., S.Y., H.M. (Heera Moon), J.J., Y.-E.J. и D.P .; формальный анализ, Б.М.; расследование, Б.М.; письменность — оригинальная черновая подготовка, Б. и Д.П .; написание — просмотр и редактирование, Б. и Д.П .; визуализация, Б.М .; надзор, Д.П .; администрация проекта, D.P .; привлечение финансирования, D.P. и J.L. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Рисунок 1. Тим-4 колокализован с Мертком. ( A ) Принципиальная схема Мертка и Тим-4. Ig, иммуноглобулин; FnIII, фибронектин типа III; PKD, протеинтирозинкиназный домен; IgV — вариабельный иммуноглобулин; ECR, внеклеточная область. ( B ) Клетки LR73, трансфицированные указанными плазмидами, инкубировали с TAMRA-меченными апоптотическими тимоцитами в бессывороточной альфа-MEM в течение 2 часов, промывали PBS, трипсинизировали и анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки, окрашенные дважды с положительным результатом на TAMRA и GFP, считались фагоцитами, поглощающими апоптотические клетки (n = 4).( C ) Клетки LR73, трансфицированные указанными плазмидами, инкубировали с TAMRA-меченными апоптотическими тимоцитами в бессывороточной альфа-MEM при 4 ° C в течение 2 часов и промывали PBS для удаления несвязанных апоптотических клеток. Затем подсчитывали связанные апоптотические клетки (n ≥ 50 клеток). ( D ) Клетки LR73, трансфицированные HA-Tim-4 и Mertk-FLAG, инкубировали с антителами против Mer и против HA, а затем окрашивали вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 594. Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии (n = 3).Масштабная линейка, 20 мкм. ( E , F ) Анализ близости лигирования выполняли с использованием клеток LR73, трансфицированных указанными плазмидами. Через день после трансфекции клетки фиксировали, блокировали и инкубировали с антителами против FLAG и против Tim-4 ^tail . Затем клетки инкубировали с раствором для амплификации при 37 ° C в течение ночи. Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии (( E ), n = 3) и количественно (( F ), n ≥ 27 клеток). Масштабная линейка 40 мкм.Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. NS, не имеет значения. ** р <0,01. *** р <0,001.

Рисунок 1. Тим-4 колокализован с Мертком. ( A ) Принципиальная схема Мертка и Тим-4. Ig, иммуноглобулин; FnIII, фибронектин типа III; PKD, протеинтирозинкиназный домен; IgV — вариабельный иммуноглобулин; ECR, внеклеточная область. ( B ) Клетки LR73, трансфицированные указанными плазмидами, инкубировали с TAMRA-меченными апоптотическими тимоцитами в бессывороточной альфа-MEM в течение 2 часов, промывали PBS, трипсинизировали и анализировали с помощью проточной цитометрии.Клетки, окрашенные дважды с положительным результатом на TAMRA и GFP, считались фагоцитами, поглощающими апоптотические клетки (n = 4). ( C ) Клетки LR73, трансфицированные указанными плазмидами, инкубировали с TAMRA-меченными апоптотическими тимоцитами в бессывороточной альфа-MEM при 4 ° C в течение 2 часов и промывали PBS для удаления несвязанных апоптотических клеток. Затем подсчитывали связанные апоптотические клетки (n ≥ 50 клеток). ( D ) Клетки LR73, трансфицированные HA-Tim-4 и Mertk-FLAG, инкубировали с антителами против Mer и против HA, а затем окрашивали вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 594.Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии (n = 3). Масштабная линейка, 20 мкм. ( E , F ) Анализ близости лигирования выполняли с использованием клеток LR73, трансфицированных указанными плазмидами. Через день после трансфекции клетки фиксировали, блокировали и инкубировали с антителами против FLAG и против Tim-4 ^tail . Затем клетки инкубировали с раствором для амплификации при 37 ° C в течение ночи. Изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии (( E ), n = 3) и количественно (( F ), n ≥ 27 клеток).Масштабная линейка 40 мкм. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. NS, не имеет значения. ** р <0,01. *** р <0,001.

Рисунок 2. Тим-4 взаимодействует с Мертком. ( A ) Клетки 293T трансфицировали указанными плазмидами. Через два дня после трансфекции клетки лизировали и Mertk с меткой FLAG осаждали гранулами агарозы, конъюгированными с антителом против FLAG. Связанные белки выявляли указанными антителами (n = 7). ( B ) Лизаты клеток 293T, трансфицированных указанными плазмидами, инкубировали с антителом tail против Tim-4 ^{и бусами агарозы с белком A / G.Связанные белки были обнаружены с помощью иммуноблоттинга (n = 3). ( C ) Лизаты перитонеальных макрофагов инкубировали с антителом против Tim-4 tail или контрольным антителом и агарозными гранулами с белком A / G. Соосажденный Mertk был обнаружен иммуноблоттингом (n = 3). ( D , E ) Клетки 293T трансфицировали указанными плазмидами и лизировали. Mertk-FLAG (( D ), n = 3) или HA-Tim-4 (( E ), n = 3) в лизатах осаждали указанными антителами, и связанные белки выявляли иммуноблоттингом.TCL, общий клеточный лизат; ИП, иммунопреципитация.}

Рисунок 2. Тим-4 взаимодействует с Мертком. ( A ) Клетки 293T трансфицировали указанными плазмидами. Через два дня после трансфекции клетки лизировали и Mertk с меткой FLAG осаждали гранулами агарозы, конъюгированными с антителом против FLAG. Связанные белки выявляли указанными антителами (n = 7). ( B ) Лизаты клеток 293T, трансфицированных указанными плазмидами, инкубировали с антителом tail против Tim-4 ^{и бусами агарозы с белком A / G.Связанные белки были обнаружены с помощью иммуноблоттинга (n = 3). ( C ) Лизаты перитонеальных макрофагов инкубировали с антителом против Tim-4 tail или контрольным антителом и агарозными гранулами с белком A / G. Соосажденный Mertk был обнаружен иммуноблоттингом (n = 3). ( D , E ) Клетки 293T трансфицировали указанными плазмидами и лизировали. Mertk-FLAG (( D ), n = 3) или HA-Tim-4 (( E ), n = 3) в лизатах осаждали указанными антителами, и связанные белки выявляли иммуноблоттингом.TCL, общий клеточный лизат; ИП, иммунопреципитация.}

Рисунок 3. Домен IgV Tim-4 связывается с доменом фибронектина III типа Mertk. ( A — C ) Клетки 293T, трансфицированные указанными плазмидами, лизировали и инкубировали с агарозными гранулами, конъюгированными с антителами против FLAG. Связанные белки были обнаружены с помощью иммуноблоттинга (( A ), n = 3; ( B ), n = 3; ( C ), n = 3). ( D ) Лизаты клеток 293T, трансфицированных указанными плазмидами, инкубировали с антителом против GFP и агарозными шариками с протеином A / G.Связанные белки были обнаружены с помощью иммуноблоттинга (n = 3). ( E ) Клетки 293T, трансфицированные указанными плазмидами, лизировали и инкубировали с анти-FLAG-конъюгированными агарозными шариками. Связанные белки выявляли иммуноблоттингом. Примечательно, что домен IgV Tim-4 был обнаружен только в иммунопреципитатах, но не в общих клеточных лизатах (n = 2). ( F ) Клетки 293T, трансфицированные указанными плазмидами, инкубировали с гранулами глутатион-сефарозы. Связанные белки были обнаружены с помощью иммуноблоттинга (n = 3).TCL, общий клеточный лизат; ИП, иммунопреципитация.

Рисунок 3. Домен IgV Tim-4 связывается с доменом фибронектина III типа Mertk. ( A — C ) Клетки 293T, трансфицированные указанными плазмидами, лизировали и инкубировали с агарозными гранулами, конъюгированными с антителами против FLAG. Связанные белки были обнаружены с помощью иммуноблоттинга (( A ), n = 3; ( B ), n = 3; ( C ), n = 3). ( D ) Лизаты клеток 293T, трансфицированных указанными плазмидами, инкубировали с антителом против GFP и агарозными шариками с протеином A / G.Связанные белки были обнаружены с помощью иммуноблоттинга (n = 3). ( E ) Клетки 293T, трансфицированные указанными плазмидами, лизировали и инкубировали с анти-FLAG-конъюгированными агарозными шариками. Связанные белки выявляли иммуноблоттингом. Примечательно, что домен IgV Tim-4 был обнаружен только в иммунопреципитатах, но не в общих клеточных лизатах (n = 2). ( F ) Клетки 293T, трансфицированные указанными плазмидами, инкубировали с гранулами глутатион-сефарозы. Связанные белки были обнаружены с помощью иммуноблоттинга (n = 3).TCL, общий клеточный лизат; ИП, иммунопреципитация.

Рисунок 4. Нарушение взаимодействия Tim-4 с Mertk отменяет синергетический эффект Mertk на опосредованный Tim-4 эффероцитоз. ( A ) Лизаты клеток 293T, трансфицированных указанными плазмидами, инкубировали с гранулами агарозы, конъюгированными с антителами против FLAG, в присутствии очищенного GST-Mertk ^FnIII или GST. Связанные белки на гранулах были обнаружены с помощью иммуноблоттинга (n = 3). ( B , C ) Клетки LR73 трансфицировали HA-Tim-4 и Mertk-FLAG.Через день после трансфекции клетки инкубировали с очищенным GST-Mertk ^FnIII или GST в течение 2 часов, окрашивали антителами против Mer и против НА и метили вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 594. Изображения получали с помощью конфокальной микроскопии (( B ), n = 2) и подсчитывали связанные апоптотические клетки (( C ), n ≥ 21 клетка). Масштабная линейка, 20 мкм. ( D ) Клетки LR73, трансфицированные указанными плазмидами, инкубировали с TAMRA-меченными апоптотическими тимоцитами в бессывороточной альфа-MEM в течение 2 часов в присутствии очищенного GST-Mertk ^FnIII или GST, промывали PBS, трипсинизировали, и проанализированы с помощью проточной цитометрии (n = 4).( E ) Клетки LR73 трансфицировали HA-Tim-4 и Mertk-FLAG. Через день после трансфекции клетки инкубировали с TAMRA-меченными апоптотическими тимоцитами в бессывороточной альфа-MEM при 4 ° C в течение 2 часов, промывали, фиксировали, окрашивали антителами против Mer и против HA и метили с помощью Alexa Fluor. Вторичные антитела, конъюгированные с 488 и Alexa Fluor 405 (n ≥ 100 клеток). Стрелки указывают на связанные апоптотические клетки. AC, апоптотические клетки. Масштабная линейка, 20 мкм. ( F ) Перитонеальные макрофаги, полученные из WT, Tim-4 ^{— / —} или Mertk ^{— / —} , инкубировали с меченными TAMRA апоптотическими тимоцитами в бессывороточной RPMI в течение 2 часов в присутствии очищенного GST- Mertk ^FnIII или GST, а затем перитонеальные макрофаги, поглощающие апоптотические тимоциты, анализировали с помощью проточной цитометрии (n = 4).Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. NS, не имеет значения. ** р <0,01, * р <0,05. TCL, общий клеточный лизат; ИП, иммунопреципитация.

Рисунок 4. Нарушение взаимодействия Tim-4 с Mertk отменяет синергетический эффект Mertk на опосредованный Tim-4 эффероцитоз. ( A ) Лизаты клеток 293T, трансфицированных указанными плазмидами, инкубировали с гранулами агарозы, конъюгированными с антителами против FLAG, в присутствии очищенного GST-Mertk ^FnIII или GST.Связанные белки на гранулах были обнаружены с помощью иммуноблоттинга (n = 3). ( B , C ) Клетки LR73 трансфицировали HA-Tim-4 и Mertk-FLAG. Через день после трансфекции клетки инкубировали с очищенным GST-Mertk ^FnIII или GST в течение 2 часов, окрашивали антителами против Mer и против НА и метили вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 594. Изображения получали с помощью конфокальной микроскопии (( B ), n = 2) и подсчитывали связанные апоптотические клетки (( C ), n ≥ 21 клетка).Масштабная линейка, 20 мкм. ( D ) Клетки LR73, трансфицированные указанными плазмидами, инкубировали с TAMRA-меченными апоптотическими тимоцитами в бессывороточной альфа-MEM в течение 2 часов в присутствии очищенного GST-Mertk ^FnIII или GST, промывали PBS, трипсинизировали, и проанализированы с помощью проточной цитометрии (n = 4). ( E ) Клетки LR73 трансфицировали HA-Tim-4 и Mertk-FLAG. Через день после трансфекции клетки инкубировали с TAMRA-меченными апоптотическими тимоцитами в бессывороточной альфа-MEM при 4 ° C в течение 2 часов, промывали, фиксировали, окрашивали антителами против Mer и против HA и метили с помощью Alexa Fluor. Вторичные антитела, конъюгированные с 488 и Alexa Fluor 405 (n ≥ 100 клеток).Стрелки указывают на связанные апоптотические клетки. AC, апоптотические клетки. Масштабная линейка, 20 мкм. ( F ) Перитонеальные макрофаги, полученные из WT, Tim-4 ^{— / —} или Mertk ^{— / —} , инкубировали с меченными TAMRA апоптотическими тимоцитами в бессывороточной RPMI в течение 2 часов в присутствии очищенного GST- Mertk ^FnIII или GST, а затем перитонеальные макрофаги, поглощающие апоптотические тимоциты, анализировали с помощью проточной цитометрии (n = 4).